Стандартная лекарственная форма при определении относительной биодоступности
В 90-е годы снова началась эпидемия туберкулеза, и в настоящее время туберкулез представляет угрозу населению планеты не меньше, чем другие инфекционные заболевания. По данным Всемирной организации здравоохранения, жертвами туберкулеза ежегодно становятся около 1,7 миллионов. Происходит быстрое распространение его лекарственно-устойчивой формы [8, 9]. Процент больных туберкулезом детей составляет 12–35 % от общего числа. В Казахстане наиболее неблагополучна в этом отношении Павлодарская область, где отмечается самый высокий уровень заболеваемости детей [3].
Отсутствие детских противотуберкулезных лекарственных средств является глобальной проблемой, которая наиболее остро стоит в развивающихся станах. Во всем мире многие лекарственные средства для детей используются без соответствующих данных об их воздействии на организм ребенка и специального разрешения. Мировой фармацевтический рынок остро нуждается и в качественных, эффективных и безопасных противотуберкулезных лекарственных препаратах в специальных детских лекарственных формах [2].
В рамках решения этой проблемы на базе ООО «РОМАТ», Казахстан, разработан состав и технология детской лекарственной формы противотуберкулезного лекарственного средства РИЗЭФ-Д рифампицин/изониазид 60/30 мг, диспергируемые таблетки на основе молекулярно инкапсулированных действующих веществ с β-циклодекстрином. Очевидным преимуществом этой композиции стала установленная на этапе доклинических исследований уменьшенная более чем в 20 раз в сравнении с аналогами острая токсичность [3].
Создание любых дженериков предполагает проведение фармакокинетических исследований и оценку биоэквивалентности, являющуюся основным видом медико-биологического контроля дженериков [5].
Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение фармакокинетики и относительной биодоступности лекарственного препарата РИЗЭФ-Д 60/30, таблетки диспергируемые (ТОО «Павлодарский фармацевтический завод», Республика Казахстан) в сравнении с препаратом рифампицин 60/изониазид 30 таблетки диспергируемые (Маклеодс Фармасьютикалс Лтд, Индия).
Материалы и методы исследования
Тестируемый лекарственный препарат производства ТОО «Павлодарский фармацевтический завод», Республика Казахстан, содержит комбинацию двух противотуберкулезных средств – рифампицина 60 мг и изониазида 30 мг.
В качестве препарата сравнения выбран аналог, не зарегистрированный в Республике Казахстан – таблетки рифампицин 60/изониазид 30, производства Маклеодс Фармасьютикалс Лтд, Индия, так как на фармацевтическом рынке Казахстана отсутствует аналог тестируемому лекарственному препарату по лекарственной форме и дозировке.
Исследования проводились на кроликах-самцах породы Шиншилла массой тела – 3,23 ± 0,39 кг, полученных из питомника ТОО НПП «Антиген» (г. Алматы).
Животным с помощью зонда внутрь вводили 1 таблетку лекарственного препарата РИЗЭФ-Д 60/30 таблетки диспергируемые или 1 таблетку лекарственного препарата рифампицин 60/изониазид 30 таблетки диспергируемые. Промежуточный период составил 7 дней, по истечении которого указанные лекарственные препараты вводили в обратном порядке.
Образцы крови (около 1,0 мл) отбирали из краевой ушной вены с помощью игл и переносили в центрифужные пробирки, предварительно обработанные гепарином. Взятие образцов крови для последующего определения содержания препарата в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени: через 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0 и 24,0 часа после перорального введения препаратов. Образцы крови отстаивались в течение 15 минут в условиях комнатной температуры. После центрифугирования (3000 об/мин в течение 10 минут) отбирали плазму крови, которая хранилась при температуре –30° С в морозильной камере «Premium».
Для количественного определения рифампицина в плазме крови использовали хроматографический метод [4]. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Agilent 1100» с УФ-детектором и компьютером с соответствующим пакетом программ для обсчета хроматограмм. Условия хроматографирования: аналитическая колонка – «Zorbax Bonus-RP», Agilent (150´4,6 мм; 5 мкм); подвижная фаза 0,01 М раствор аммония фосфата двузамещенного – ацетонитрил (50:50), профильтрованная через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и дегазированная на ультразвуковой бане; скорость потока элюента – 1,0 мл/мин; детектирование при длине волны 215 нм; температура колонки + 35 °С.
Для экстракции рифампицина из плазмы крови в экстракционную пробирку, содержащую 1 мл плазмы крови, добавляли 5,0 мл смеси пентан:дихлорметан (1:1), встряхивали на шейкере и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант переносили в выпарительную колбу. Органическую фракцию выпаривали досуха на роторном испарителе в токе азота. Сухой остаток растворяли в 250 мкл подвижной фазы и по 50 мкл аликвоты вводили в петлю инжектора.
Процент извлечения рифампицина из плазмы крови составил в среднем 83,9 ± 7,5 %. Количественное определение рифампицина проводили методом абсолютной калибровки. Установлено, что в диапазоне концентраций 5–40 мкг/мл калибровочная кривая линейна. Стандартная кривая рифампицина описывалась уравнением y = 34,033x – 85,17 (R2 = 0,9997), где y – площадь хроматографического пика рифампицина; х – концентрация в мкг/мл (рис. 1–3). Минимальная обнаруживаемая концентрация составила 25 нг/мл. Относительная ошибка метода для концентрации 5 мкг/мл не превышала 29,76 %.
Рис. 1. Хроматограмма стандартного раствора рифампицина 20 мкг/мл
Рис. 2. Хроматограмма стандартного раствора рифампицина в плазме крови in vitro
Рис. 3. Хроматограмма плазмы крови кролика через 0,5 ч после введения препарата РИЗЭФ-Д 60/30
Полученные данные предварительно были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «Excel». Расчет фармакокинетических параметров анализируемых препаратов был проведен с использованием программы «ANOVA».
Результаты исследования и их обсуждение
На рис. 1 представлена хроматограмма стандартного раствора рифампицина с концентрацией 20 мкг/мл, на рис. 2 – хроматограмма плазмы крови кролика in vitro с концентрацией 40 мкг/мл, на рис. 3 – хроматограмма плазмы кролика через 0,5 часа после введения препарата РИЗЭФ-Д 60/30. Из хроматограмм видно, что время удерживания пика рифампицина лежит в пределах от 5,8 до 7,4 мин.
С целью оценки биологической доступности исследуемых лекарственных форм были определены концентрации рифампицина в сыворотке крови кроликов при применении препаратов, рассчитаны основные фармакокинетические параметры, позволяющие количественно охарактеризовать относительную биодоступность (f), величины площадей под фармакокинетическими кривыми зависимости «концентрация ‒ время» (AUC0-360), время достижения максимальной концентрации (Тmax) и значения максимальных концентраций (Сmax) [1, 6, 7].
На рис. 4 представлен усредненный фармакокинетический профиль рифампицина после введения тестируемого и референс-препаратов.
Профили концентраций рифампицина тестируемого и референс-препаратов схожи. Фармакокинетические кривые рифампицина показывают, что исследуемое соединение определяется на протяжении 12 часов после однократного введения животным и испытуемого лекарственного препарата, и препарата сравнения.
В табл. 1 представлены фармакокинетические параметры рифампицина у кроликов после введения исследуемых лекарственных препаратов.
Рис. 4. Усредненный фармакокинетический профиль рифампицина в плазме крови кроликов после однократного перорального введения лекарственных препаратов
Индивидуальные и средние значения фармакокинетических параметров рифампицина тестируемого (Т) и референс-препаратов (R)
Источник
Стандартная лекарственная форма при определении относительной биодоступности
По данным Всемирной организации здравоохранения, жертвами туберкулеза ежегодно становятся порядка 1,7 миллионов и ежедневно умирают около 5 тысяч человек. Происходит быстрое распространение лекарственно-устойчивой формы туберкулеза. В отчете ВОЗ «Глобальный доклад 2010 года об эпидемическом надзоре и ответных действиях» от 18 марта 2010 г., особое внимание уделяется росту заболеваемости множественным лекарственноустойчивым туберкулезом [9].
По данным ВОЗ, в некоторых районах мира у каждого четвертого человека с туберкулезом развивается форма болезни, которая не поддается стандартному лечению противотуберкулезными препаратами первой линии. В настоящее время к странам, где наблюдается высокий уровень заболеваемостью туберкулезом с приобретенной множественной и широкой лекарственной устойчивостью, относятся и страны СНГ, в том числе Россия и Казахстан.
Крайне неблагоприятная ситуация складывается в отношении лечения детей, больных туберкулезом, поскольку в мире ранее не выпускались специальные лекарственные формы для детей. В основном для лечения детей использовались лекарственные препараты, предназначенные для взрослых. В этих случаях таблетки размалывали и расфасовывали в соответствующих дозах. В большинстве случаев это приводило к снижению терапевтической активности лекарственных препаратов и проявлению ряда побочных эффектов[9, 10].
В декабре 2007 года ВОЗ была объявлена глобальная кампания по производству лекарственных средств для детей, вызванная необходимостью улучшения доступа к безопасным лекарствам для всех детей в возрасте до 15 лет. Оптимальными для детей лекарственными препаратами являются адаптируемые твердые оральные формы, предпочтительно диспергируемые таблетки [3].
Фармацевтической компанией «РОМАТ», Казахстан, разработан состав и технология нового детского лекарственного препарата – Изониазид-Д (диспергируемые таблетки) на основе инкапсулирования изониазида с β-циклодекстрином для снижения токсичности, маскировки неприятного вкуса и повышения стабильности при хранении противотуберкулезного препарата изониазида [2].
Создание воспроизведенных лекарственных препаратов (дженериков) предполагает обязательное проведение фармакокинетических исследований, оценку их биоэквивалентности оригинальному лекарственному препарату, что является основным видом медико-биологического контроля их качества [1, 5].
Исходя из сказанного, целью настоящей работы явилось изучение относительной биодоступности Изониазида-Д таблетки диспергируемые производства ТОО «Павлодарский фармацевтический завод», Республика Казахстан, в сравнении с лекарственным препаратом Изониазид таблетки диспергируемые (Кадила Фармасьютикалс Лтд, Индия).
Материалы и методы исследования
Изониазид – противотуберкулезный препарат первого ряда, производное гидразида изоникотиновой кислоты (гидразид 4-пиридинкарбоновой кислоты).
Тестируемый препарат – таблетки диспергируемые изониазид 0,1 г производства ТОО «Павлодарский фармацевтический завод», Республика Казахстан. В качестве препарата-сравнения выбран аналог, не зарегистрированный в Республике Казахстан – таблетки диспергируемые 0,1 г производства Кадила Фармасьютикалс Лтд, Индия, так как на фармацевтическом рынке Казахстана отсутствует аналог тестируемого препарата по лекарственной форме и дозировке.
Исследование проводилось на кролика-самцах породы Шиншилла массой тела – 3,19 ± 0,41 кг, полученных из питомника ТОО НПП «Антиген» (г. Алматы).
В «случайном» порядке животным с помощью зонда внутрь вводили 1 таблетку испытуемого лекарственного препарата Изониазида-Д таблетки диспергируемые 0,1 (Т) или 1 таблетку препарата сравнения Изониазид таблетки диспергируемые 0,1 (R). Промежуточный период составил 7 дней, по истечении которого препараты вводили в обратном порядке.
Образцы крови (около 1,0 мл) отбирали из краевой ушной вены с помощью игл и переносили в центрифужные пробирки, предварительно обработанные гепарином. Взятие образцов крови для последующего определения содержания препарата в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени: через 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0 и 24,0 часа после их перорального введения. Образцы крови отстаивались в течение 15 минут в условиях комнатной температуры. После центрифугирования (3000 об/мин в течение 10 минут) отбирали плазму крови, которая хранилась при температуре –30 °С в морозильной камере «Premium».
Для количественного определения изониазида в плазме крови использовали хроматографический метод [4]. Анализ проводили на жидкостном хроматографе «Agilent 1100» с УФ-детектором и компьютером с соответствующим пакетом программ для обсчета результатов. Условия хроматографирования: аналитическая колонка – «Zorbax Bonus-RP», Agilent (150´4,6 мм; 5 мкм); подвижная фаза: градиент растворителей А и В, профильтрованная через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и дегазированная на ультразвуковой бане; скорость потока элюента – 1,0 мл/мин; детектирование проводили при длине волны – 280 нм; температура колонки + 35 °С.
Для экстракции изониазида из плазмы крови 0,5 мл плазмы помещали в пробирку Centrisart I и центрифугировали в течение 15 мин при 4500 об/мин. По 50 мкл надосадочной жидкости вводили в петлю инжектора. Процент извлечения изониазида составил 84,6 % ± 6,7 (среднее из 3 определений). В диапазоне концентраций 10; 25; 50 и 100 мкг/мл калибровочная зависимость была линейной.
Количественное определение изониазида проводили методом абсолютной калибровки. В описанных условиях время удерживания изониазида составило 3,25–4,33 мин. В диапазоне концентраций 10–100 мкг/мл калибровочная кривая была линейной. Стандартная кривая изониазида описывалась уравнением: y = 46,756x + 178,42 (R2 = 0,9636), где y – площадь хроматографического пика изониазида; х – концентрация в мкг/мл. Минимальная обнаруживаемая концентрация составила 0,01 мкг/мл; относительная ошибка для концентрации 100 мкг/мл не более 32,8 %.
Полученные данные предварительно были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «Excel». Расчет фармакокинетических параметров анализируемых препаратов был проведен с использованием программы «ANOVA».
Результаты исследования и их обсуждение
С целью оценки биологической доступности исследуемых лекарственных средств были определены концентрации изониазида в сыворотке крови кроликов: рассчитаны основные фармакокинетические параметры, позволяющие количественно охарактеризовать относительную биодоступность (f), величины площадей под фармакокинетическими кривыми зависимости «концентрация-время» (AUC0-360), время достижения максимальной концентрации (Тmax) и значения максимальных концентраций (Сmax) [1, 7].
На рисунке представлен усредненный фармакокинетический профиль изониазида после введения тестируемого и референс-препаратов.
Усредненный фармакокинетический профиль изониазида в плазме крови кроликов после однократного перорального введения Изониазида-Д (Т) и Изониазида (R)
Профили концентраций изониазида препаратов Изониазид-Д (T) и Изониазид (R) схожи. Фармакокинетические кривые изониазида показывают, что исследуемое соединение определяется на протяжении 12 часов после однократного введения животным испытуемого препарата и препарата сравнения.
В табл. 1 представлены фармакокинетические параметры изониазида у кроликов после введения исследуемых препаратов.
Индивидуальные и средние значения фармакокинетических параметров изониазида тестируемого (Т) и референс-препаратов (R)
Источник
