С химической точки зрения пирогены — это сложные вещества с высокой молекулярной массой и размером частиц от 50 до 1 мкм, состоящие в основном из липополисахаридов, адсорбированных на белковом носителе. Например, химический состав пирогенного вещества, выделенного из Proteus Vulgaris, состоит из углерода (25,83%), водорода (6,06%), азота (6%), фосфора (0,29%) и золы (8,33%).

Пирогены растворимы в воде, нерастворимы в спирте и ацетоне, устойчивы к воздействию повышенной температуры. Нагревание в автоклаве при 120°С в течение 20 мин приводит к гибели бактерий, но не уничтожает пирогены. Чувствительность пирогенов к высокой температуре различна. Изменение pH водного раствора практически не влияет на термолабильность пирогенов. В сухом виде их полное разложение происходит только при температуре 200°С в течение 30 мин; стерилизация сухим воздухом при 160°С в течение 2 ч не гарантирует полной апирогенности. Повышение температуры позволяет сократить время, необходимое для уничтожения пирогенов. При температуре 600°С достаточно минутного нагревания, при 450°С — двухминутного, следовательно, освободить от них воду и инъекционные растворы термической стерилизацией практически невозможно.

Пирогенные вещества чувствительны к действию окислителей, например, перекиси водорода или перманганата калия.

Пирогены обладают очень малыми размерами и пррходят через самые плотные фильтры с размерами пор от 0,005 до 0,001 мкм.

Существуют различные методы обнаружения и удаления пирогенов из растворов.

2.3 Методы обнаружения пирогенов

а) химические;

б) физические;

в) биологические.

Химические методы основаны на проведении определенных цветных реакций.

Физические методы основаны на измерении электропроводности и полярографических максимумов.

Из-за ряда недостатков первых двух методов чаще всего применяют методы биопроб, которые введены в Фармакопеи различных стран мира.

Биологические методы. До настоящего времени основным и официально принятым во всех странах методом испытания лекарственных средств на наличие пирогенных примесей считается метод, основанный на троекратном измерении температуры тела кролика после внутривенного введения исследуемого препарата. Повышение температуры на 0,6°С или более, согласно требованию фармакопей, считается доказательством наличия пирогенов.

Специальные статьи Фармакопей оговаривают условия . проведения этого испытания, поскольку факторы — химический (корм), физический (изменение температуры окружающей среды), физиологический (возбуждение животных при анальном измерении температуры) — могут повлиять на результат испытания. И даже при самом строгом соблюдении требований к проведению испытаний невозможно избежать случайных ошибок, связанных с индивидуальной чувствительностью животных к пирогену и препарату, различными климатическими условиями, времени постановки опыта и т. п. Все это может отразиться на показателях температуры, измеренной с точностью до ±0,1°С.

Согласно данным различных Фармакопей доза одного и того же препарата в ряде случаев колеблется в широких пределах. Очень часто при равных или весьма близких дозах препаратов объемы вводимых растворов различаются в 5 раз. Отмечено, что наблюдается большой разрыв между дозами для кроликов и человека. Нередко эти дозы различаются в 100—6000 раз. По мнению ученых, изучавших этот вопрос, тест-доза препарата при испытании пирогенности должна подбираться индивидуально, учитывая его фармакологию, переносимость кроликом, и ориентировочно должна составлять 1/10 максимальной суточной дозы для человека.

Существует вариант условий признания препарата пирогенным либо алирогенным: воду или раствор лекарственного средства считают апирогенным, если сумма максимальных повышений температур у 3 кроликов не превышает 1,2°С, и пирогенным, если она равна или больше 2,2°С. Если сумма повышений температуры у 3 кроликов больше 1,2°С, но меньше 2,2°С, то испытание повторяют на 5 кроликах. Воду или раствор лекарственного средства считают пирогенным, если сумма повышений температуры у 8 кроликов равна или больше 3,8°С, в противном случае — апирогенным.

В последнее время заметное распространение получает метод испытания лекарственных средств на пирогенность in vitro с использованием лизата амебоцитов краба Лимулюс. Этот метод имеет ряд преимуществ перед фармакопейным: он чувствительнее в 5—10 раз, результат получается быстрее, возможно количественное определение пирогена. Кроме того, с его помощью возможен контроль препаратов, которые нельзя испытать на кроликах. Одним из недостатков этого метода является его специфичность в отношении эндотоксина грамотрицательных бактерий, т. е. опасность не выявить наличие в лекарственных средствах пирогенов другого происхождения.

2.4 Методы удаления пирогенных веществ

1. химические;

2. физические;

3. энзиматические.

Химические методы удаления пирогенов. Растворы, содержащие пирогены, нагревают при 100°С в течение 2 ч с добавкой 0,1 моля перекиси водорода. Эффективен способ нагрева растворов при температуре 116°С в течение 20 мин с добавкой 0,04 моля перекиси водорода.

Ряд методов основан на применении раствора перманганата калия. Рекомендуется прибавлять к раствору небольшое количество гипохлорида (щавелевой воды): на 1 л добавляют 0,25 мл раствора гипохлорида натрия с содержанием активного хлора около 0,5%, смесь выдерживают 30 мин. Избыток гипохлорида удаляют с помощью активированного угля (из расчета 15% от объема воды). Для удаления пирогенов предлагается также обрабатывать растворы п-хиноном и антрахиноном, образующих с пирогенами комплексные соединения.

Для уничтожения пирогенных веществ можно использовать подогрев раствора с 0,1Н раствором едкого натра или 0,1Н раствором соляной кислоты (при рН 4,0) в течение 1 ч. Происходит гидролитическое расщепление пирогенов с образованием моносахаридов, не обладающих пирогенными свойствами. Расход кислоты и щелочи при этом очень велик, поэтому данный метод следует назвать неэкономичным.

Из-за возможного взаимодействия компонентов, химический и энзиматический методы мало приемлемы при промышленном изготовлении растворов для инъекций.

Физические методы. Основываются на явлении адсорбции пирогенов активированным углем, каолином, асбестом, целлюлозой и т. п. Количество пирогенных веществ уменьшается после обработки активированным углем путем встряхивания в течение 15 мин, при этом эффективность очистки зависит от природы пирогенных веществ. Гранулированный уголь менее эффективен. Уголь, применяемый для очистки растворов, должен быть тщательно очищен, хорошо промыт водой, не содержать пирогенов и высушен при температуре 250°С в течение 2 ч. Однако обработка растворов активированным углем не всегда приводит к полной депирогенизации. Кроме того, данный метод нельзя применять для очистки растворов лекарственных веществ, легко адсорбируемых углем, например, солей алкалоидов, или легко окисляемых, например аскорбиновой кислоты.

Ряд авторов рекомендуют для очистки от пирогенов использовать ионообменные смолы (например, для аминокислот), считая, что они более эффективны, чем активированный уголь. Депирогенизацию воды можно осуществить путем фильтрования через бактериальный фильтр Зейтца. Размер пор многих бактериальных фильтров такой же, как у фильтра Зейтца, но они не пригодны для удаления пирогенных веществ, поэтому нельзя объяснить эффективность удаления пирогенных веществ только малым диаметром пор. Рекомендуется, чтобы диаметр пор фильтра Зейтца не превышал 2,4 мкм. Фильтр Зейтца задерживает пирогенные вещества из раствора на 99,5%, даже когда они находятся в значительном количестве. Чем меньше концентрация пирогенных веществ в растворе, тем лучше они задерживаются на фильтре.

Обработка раствора активированным углем с последующим фильтрованием через фильтр Зейтца обеспечивает более полное удаление пирогенных веществ.

Для удаления пирогенных веществ из растворов аминокислот, применяемых для внутривенного вливания, предлагается их автоклавирование при температуре 120°С в течение 2—3 ч в атмосфере азота.

Уменьшение пирогенных веществ происходит при термической стерилизации в течение 20 мин при 120°С, а при 140°С в течение 20 мин наступает их инактивация. Полное уничтожение пирогенных веществ достигается стерилизацией в сушильном шкафу при температуре 200°С в течение 45 мин или при 250°С в течение 30 мин. При температуре 120°С пирогенность уменьшается в процессе автоклавирования на следующие величины: в течение 30 мин на 25, 1 ч — на 70, 2 ч — на 95, 4 ч — на 100%.

К физическим методам удаления пирогенов из растворов следует отнести уничтожение их с помощью ультразвука с частотой 2 МГц и интенсивностью 2 Вт/см2 в течение 10 мин. При этом достигается полное разрушение пирогенных веществ. В то же время ультразвук в 800 МГц и интенсивностью 1,5 Вт/см2 в течение 5— 10 мин незначительно снижает пирогенность воды. При действии ультразвука рН воды изменяется на ±0,75.

Государственным научным центром лекарственных средств совместно с отделом биохимических методов очистки воды АН Украины (Ф. А. Конев, Т. П. Скубко, П. И. Гвоздяк) предложен оригинальный фильтр для получения апирогенной воды. Действие фильтра основано на удерживании микроорганизмов диэлектрическими материалами в электрическом поле, силовые линии которого направлены перпендикулярно к движению потока стерилизуемой жидкости.

Срок использования воды для инъекций регламентируется 24 ч с момента получения, при условии ее хранения в асептических условиях. При более длительном хранении вода поглощает из воздуха углерода диоксид и кислород, может взаимодействовать с материалом используемой емкости, вызывая переход ионов тяжелых металлов, и является средой для размножения микроорганизмов. Поэтому наиболее предпочтительно использование свежеприготовленной воды, которую иногда непосредственно после дистилляции кипятят в течение 30 мин.

Более надежное хранение гарантируется специальными системами, выполненными из инертного материала. Вода в них находится при высокой температуре и в постоянном движении.

Глава 3. Приготовление растворов