Лекарственное растительное сырье противомикробного действия
В настоящее время доказано, что многие микроорганизмы обладают резистентностью по отношению к большому количеству антибиотиков и, в некоторых случаях, для достижения терапевтического эффекта необходимо повышение дозы препарата, что может отрицательно повлиять на организм. Поэтому, на наш взгляд, является весьма актуальным поиск альтернативных растительных средств с подобным антибактериальным эффектом и отсутствующей к ним устойчивости штаммов микроорганизмов.
Род копеечник (Hedysarum) относится к семейству бобовых (Fabaceae) и насчитывает более 250 видов. В России произрастает более 100 видов данного растения [1]. Копеечники обладают широким спектром фармакологических эффектов: противовоспалительное, противоопухолевое, иммуностимулирующее, тонизирующее действие и др. [2, 3, 4], а также у некоторых представителей данного рода обнаружена противовирусная и антибактериальная активности [5]. По данным M. Kubo и соавторов, выделенный из бензольной фракции корней Н. polybotrys птерокарпан проявил антибактериальное действие. Минимальная ингибирующая концентрация для Mycobacterium tuberculous составила 10 мкг/мл [6].
Ранее в нашей работе [7] мы сообщали об антимикробной активности некоторых видов копеечников. Было установлено, что наиболее выраженным противомикробным действием обладает водно-спиртовый экстракт, полученный из копеечника забытого — 83 % эффекта; копеечник чайный показал 50 % эффекта, копеечник альпийский — 16,6 % эффекта. По предварительным данным, найденные противомикробные эффекты определяются конденсированными (олигомерными) танинами [7].
По сведениям В.А. Бандюковой, антибактериальная активность обусловлена также наличием флавоноидов в растениях данного вида [8].
Целью данного исследования являлась сравнительная оценка антибактериального действия фитопрепаратов (ФП), полученных из корней растений рода копеечника (H. theinum, H. neglectum, H. alpinum) по сравнению с 1 %-м раствором танина, а также с некоторыми препаратами антибиотиков (гентамицина сульфат, азитромицин).
Материалы и методы исследования
При изучении антимикробной активности фитопрепаратов растений рода Hedysarum сем. Fabaceae использовали классические микробиологические методы — метод культивирования микроорганизмов на среде с добавлением ФП, метод рассева петлей (посев штрихами) и определение антибиотикочувствительности стандартизированным методом Керби-Бауэра (оригинальный диско-диффузионный метод) [9].
В работе были использованы 4 штамма микроорганизмов. Микроорганизмы относились к следующим семействам: Enterobacteriaceae представлено Escherichia coli (1 штамм) и родам Klebsiella pneumoniae (1 штамм); семейство Pseudomonaceae — Pseudomonas aeruginosa (1 штамм); семейство Coccaceae — Staphylococcus aureus (1 штамм). Посев микроорганизмов осуществляли методом рассева петлей на питательный агар, содержащий исследуемые фитопрепараты. Тест-культуры суточных микроорганизмов были взяты в последовательном разведении (1:100.000.000, 1:100.000, 1:100). Приготовление испытуемого штамма бактерий тест-культур осуществлялся по стандарту 1 млрд микробных клеток в 1 мл.
В качестве контроля высевали тест-культуры, взятые в тех же разведениях на питательные среды с добавлением 1 %-го раствора танина (ФП №1). Результаты опыта отмечали после 24 ч. инкубирования в термостате при температуре 37 °С .В дальнейшем определяли чувствительность микроорганизмов к антибиотикам гентамицина сульфату, азитромицину взятых в концентрации 20 мкг/мл методом диско-диффузионным и исследуемым ФП. Всего в работе было взято по 8 чашек Петри с питательным агаром на 1 исследуемый штамм. В опытной серии представлено 6 ФП: копеечник чайный (производитель г. Томск, Россия, ФП №2), копеечник чайный (производитель Китай, ФП №3), «Красный корень» (производитель г. Бийск, Россия, ФП №4), водно-спиртовые экстракты копеечника забытого (ФП №5), копеечника чайного (ФП №6), копеечника альпийского (ФП №7) приготовленных по оригинальной авторской методике (решение о выдаче патента РФ на изобретение от 24.05.2010 г.). ФП №2 и ФП №3 любезно предоставлены д-р фарм. наук, проф. Николаевой Л.А. (Санкт-Петербург). Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью статистического пакета Statistica 6,0 (Stat Soft, Inc). Сравнение величин в случае нормального распределения проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Различия между группами считали статистически значимыми при р
Источник
Лекарственное растительное сырье противомикробного действия
Лекарственные препараты, получаемые из растений, занимают достойное место среди средств профилактики и лечения многих заболеваний. На сегодняшний день в Государственном реестре лекарственных средств МЗ РФ приведено около 300 видов растений, применяемых в научной медицине и используемых для приготовления лекарственных средств [5]. В целом же в фитотерапии — научной и народной медицине, гомеопатии и ветеринарии используется около двух тысяч видов растений [12]. При этом биоразнообразие лекарственных растений используется далеко не полностью, что связано с отсутствием данных о ресурсах, недостатком сведений о химическом составе растительного сырья и малой изученностью фармакологических свойств фитопрепаратов [7].
Повсеместное распространение многих лекарственных растений, дешевизна получаемых из них препаратов и высокая физиологическая активность комплекса биологически активных (действующих) веществ — все это не может не привлекать внимание исследователей. Поэтому, одной из актуальных проблем медицинской и биологической науки является поиск новых источников лекарственного растительного сырья, способных расширить сырьевую базу и обновить ассортимент лекарственных средств растительного происхождения.
Растения в процессе роста и развития вырабатывают и накапливают вещества первичного и вторичного синтеза. Вещества первичного синтеза — белки, углеводы и липиды, выполняют в клетках энергетическую, пластическую и ряд других функций, обеспечивая процессы жизнедеятельности. Вещества вторичного синтеза представляют собой химические соединения, обладающие фармакологической активностью и способные оказывать регулирующее влияние на процессы обмена в растительных и животных организмах [13, 16]. Компоненты вторичного синтеза — флавоноиды, иридоиды, азотсодержащие вещества, фитонциды, эфирные масла, таниды, гликозиды, сапонины, ферменты, кумарины, органические кислоты, горечи и многие другие соединения, накапливаемые растениями и обладающие фармакологической активностью и терапевтическим действием, принято называть биологически активными веществами (БАВ).
Исследуя флору Предуралья в период экспедиций (1970-1988 и 1999-2010 гг.), мы обратили внимание на растения рода вероника — Veronica L., семейства Норичниковых — Scrophulariaceae Juss., которые имеют обширный ареал в Евразии и часто входят в состав субдоминантов растительных сообществ [8, 9]. Значительное число видов указанного рода широко применяются в фитотерапии нашей страны и ряда стран Западной Европы и Центральной Азии [1, 3, 11, 12, 14, 15].
В народной медицине препараты из растений рода Veronica применяются в качестве противовоспалительных, отхаркивающих, седативных, кровоостанавливающих, антитоксических и ранозаживляющих средств [1, 6, 8, 11, 12, 14, 19]. Некоторые виды рода Veronica обладают противораковым действием [3]. Вероника лекарственная — V. officinalis включена в состав многих сборов, лечебных чаев и биологически активных пищевых добавок [6]. Виды Veronica L. широко используются для лечения кожных болезней в ветеринарной практике, а их препараты, при исследовании на животных, показали эффективность при заболеваниях сердечно-сосудистой системы [6].
Целью нашего исследования являлось установление антибактериальных свойств препаратов, полученных из сырья растений рода Veronica, произрастающих в лесостепной и степной зонах Предуралья.
Из многообразия видов Veronica нами были выбраны наиболее распространенные в регионе представители: V.officinalis L. — в. лекарственная, V. spicata L. — в. колосистая, V. incana L. — в. седая и V. spuria L. — в. ненастоящая.
Материалы и методы исследования
Растительное сырье для исследования (надземная часть — трава) было заготовлено в период цветения растений в различных биомах Предуралья (2007-2010 гг.) и высушивалось воздушно-теневым способом.
В. лекарственная, относящаяся к растениям-мезофитам и встречающаяся в хвойных лесах была собрана в сосновом бору группы ассоциаций Pineta herbosa Кунгурско-Красноуфимской лесостепи Среднего Предуралья (окр. д. Крылово, Красноуфимского района Свердловской области).
В. ненастоящая, являющаяся ксеромезофитом была собрана на остепненных лугах (Александровские сопки, Красноуфимского района Свердловской области).
Два оставшихся вида: в. колосистая и в. седая относятся к группе ксерофитов и ареал их произрастания охватывает степную зону Южного Предуралья. В. колосистая собрана на остепненных лугах в злаково-разнотравных ассоциациях (окрестности с. Каменноозерное Оренбургского р-на, Оренбургской области)., а в. седая — на степных участках (каменистая степь) в типчаково-разнотравной ассоциации (окресности с. Саракташ, Оренбургской области).
На первом этапе нами проводилось фитохимическое исследование растений на содержание основных групп действующих веществ, оказывающих влияние на биологические процессы в растительных и животных организмах. Исследованию подвергались надземные органы растений (трава), собранные в период цветения растений в 2007-2010 гг. Обнаружение, идентификация и количественное определение алкалоидов, флавоноидов, дубильных веществ, сапонинов, кумаринов и иридоидов проводили методами принятыми Всероссийским Институтом Лекарственных Растений (ВИЛР) и Институтом биохимии растений РАН [4, 13, 16].
Для выявления антимикробной активности комплекса биологически активных веществ в видах рода Veronica из сырья растений нами были изготовлены сухие экстракты полифенольных соединений. Сухие экстракты готовили с использованием метода турбоэкстракции [2], основанном на вихревом перемешивании (с количеством оборотов до четырех тысяч в минуту) сырья и экстрагента при одновременном измельчении сырья. В качестве экстрагента использовали воду, нагретую до температуры 40-42 °С и этанол различной концентрации (табл. 1). Вытяжку отстаивали при температуре +5 °С в течение трёх суток, затем фильтровали, сгущали и высушивали в сушильном шкафу при температуре 70 °С. Полученный экстракт — порошок бурого цвета, исследовали на наличие флавоноидов методом двумерной хроматографии на бумаге.
Испытание антибактериальной активности полученных препаратов проводили в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. В качестве тест-микроорганизмов были использованы штаммы, рекомендуемые для исследования препаратов [4, 10, 17]: культура золотистого стафилококка — Staphyloccus aureus, штам-209 и культура кишечной палочки — Escherichia coli, штамм М-17, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов (г. Москва).
Исследования проводилось нами на жидких питательных средах методом двукратных серийных разведений [10]. Для этого готовили двукратное разведение извлечений в мясопептонном бульоне. Разведение готовили непосредственно в пробирках, подлежащих засеву. В каждом ряду разведений для контроля имели равное количество пробирок с соответствующими разведениями этилового спирта и две пробирки со средой без извлечения, а при исследовании водных извлечений в качестве контроля брали две пробирки со средой без извлечения.
Культуры для экспериментов готовились следующим образом: суточные агаровые культуры переносили петлёй в пробирку с физиологическим раствором, где находилось исходное разведение в 500 млн микробных тел в 1 мл по оптимальному стандарту. Полученную взвесь разводили бульоном, вначале в 100, а затем еще в 10 раз, для того, чтобы получить взвесь микробов содержащую 500 000 микробных тел в 1 мл, которая являлась рабочим разведением культуры. Изготовленную культуру вносили по 1 мл как в пробирки с извлечением, так и в контрольные, не содержащие извлечений.
Бактериальная нагрузка составляла, таким образом, 250 000 микробных тел в 1 мл. Вслед за этим штативы с пробирками помещались в термостат при температуре +37 °С. Результаты опыта учитывались через 20-24 часа. Регистрировали наличие роста (помутнение) или задержку роста в среде за счет бактериостатического действия извлечений. За действующую дозу принимали ту наименьшую концентрацию извлечения, при которой наблюдается задержка роста бактериальных культур [10].
Результаты исследования и их обсуждение
Фитохимическое исследование видов Veronica показало, что в исследуемых растениях наиболее характерными соединениями являются флавоноиды, таниды, азотистые вещества основного характера и иридоиды.
Основными действующими веществами в сырье растений являются флавоноиды группы флавона [6, 8, 13], составляющие комплекс полифенольных соединений. Химическая структура производных флавона — флавоноидов включает два ароматических кольца, соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом (С6-С3-С6):
Структура флавоноидов варьирует за счет изменения числа и положения гидроксильных групп, наличия или отсутствия С = O — группы в кольце С, положением кольца В. Флавоноиды способны образовывать гликозиды, эфиры и другие производные, отличающиеся по своим химическим и фармакологическим свойствам.
При исследовании сырья указанных видов Veronica методом двумерной хроматографии на бумаге в растениях обнаружены флавоноиды (до 16 соединений) и фенолкарбоновые кислоты (до 9 веществ). При этом нами [6, 8, 15] выделены и идентифицированы основные флавоноиды вероник: лютеолин (5,7,3´,4´-тетраоксифлавон), апигенин (5,7,4´-триоксифлавон), апигенин-7-β-D-глюкуронид; цинарозид или лютеолин-7-0-β-D-глюкопиранозид (5, 3´, 4´-триоксифлавон-7-0- β-D-глюкопиранозид).
Лютеолин-7-глюкозид (5, 7, 3´, 4´-тетраоксифлавон) Апигенин (5, 7, 4´-триоксифлавон)
Цинарозид (лютеолин7-0-β-D-глюкопиранозид или 5, 3´,4´-триоксифлавон-7-0-β-D-глюкопиранозид) Гликозид апигенина (апигенин-7-β-D-глюкуронид)
Определение суммы флавоноидов в сырье показало незначительное повышение их содержания в растениях, собранных в степной зоне Южного Предуралья. Наибольшее количество флавоноидов извлекается при использовании в качестве экстрагента 40 и 70%-го этанола. В экстрактах из травы V. officinalis обнаружено шесть основных веществ флавоновой природы, в V. incana — пять, а в V. spicata — семь соединений. Установлено, что основными соединениями в сухих экстрактах являются: лютеолин, апигенин и их гликозиды. Таким образом, исследование содержания суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в препаратах из травы видов Veronica позволяет утверждать, что оптимальным экстрагентом является 40% этанол (таблица).
Для многих флавоноидов установлено антиоксидантное, противомикробное, противовоспалительное, противораковое действие [1, 3, 12, 13, 14, 18, 19], что обусловило широкое применение флавоноидсодержащего растительного сырья для производства лечебных и профилактических средств. Идентифицированные нами в растениях рода Veronica флавоноиды обладают выраженным противовоспалительным и противовирусным действием [1, 15], антиоксидантной активностью и способствуют восстановлению функциональной активности иммунной сис- темы [18, 19].
Кроме флавоноидов в исследуемых растениях нами выявлены фенолкарбоновые кислоты, четыре из которых идентифицированы как кофейная, хлорогеновая, неохлорогеновая и феруловая кислоты [8, 18]. Но в сухих препаратах рода Veronica L. выявлены только три фенолкарбоновые кислоты, две из которых идентифицируются как хлорогеновая и кофейная:
Оценка антимикробного действия препаратов — сухих экстрактов из видов рода Veronica L. и содержание в них флавоноидов
Источник
