Лекарственное растение viscum album

Терапия с внутриопухолевым применением препарата омелы ViscumAlbum

Friedmann Schad, Jan Axtner, Dirk Buchwald, Antje Happe, Stephan Popp, Matthias Kroez и Harald Mattes; IntergrCancer Ther опубликовано онлайн 19 декабря 2013 г.

Реферат

Рак поджелудочной железы остается одной из основных причин случаев смерти, связанных с раковыми заболеваниями. Внутриопухолевое применение противораковых агентов обсуждается как перспективный метод лечения твердых опухолей, таких как рак поджелудочной железы. Эндоскопическое применение ультразвука дает хорошую возможность для обследования и лечения поджелудочной железы. Европейская омела (Viscum album L.) является фитотерапевтическим средством, часто применяемым в Центральной Европе в области комплексной онкологии. Ее применение в качестве дополнительного средства имеет целью индуцировать иммуностимуляцию и противоопухолевые эффекты, а также облегчить побочные эффекты химиотерапии.

Внутриопухолевое применение омелы вызывало локальную реакцию опухоли при различных видах рака. Такое нестандартное применение требует тщательной валидации в плане безопасности и полезности. Здесь мы сообщаем данные о 39 пациентах с прогрессирующим неоперабельным раком поджелудочной железы, которые получили в общей сложности 223 внутриопухолевые дозы препарата омелы, либо с помощью эндоскопической ультрасонографии, либо в условиях трансабдоминального ультразвукового контроля. О каких-либо тяжелых побочных эффектах, связанных с этой процедурой, не сообщается. Неблагоприятные реакции на лекарство представляли собой главным образом повышение температуры или жар в 11 % и 14 % случаев его применения, соответственно. Другие неблагоприятные реакции на лекарство, такие как боль или тошнота, имели место в менее чем 7% случаев применения.

Тяжелых неблагоприятных реакций на лекарство зарегистрировано не было. Пациенты получали стандартную химиотерапию первого и второго уровня, подвергались адекватным паллиативным хирургическим вмешательствам, а также получали дополнительно препараты омелы: подкожно и отчасти внутривенно. Средний период выживания для всех пациентов составил 11 месяцев: 11.8 и 8.3 месяца для стадий II и IV, соответственно. Из-за многомодальности терапевтического подхода и отсутствия контрольной группы эффект от внутриопухолевого применения препарата омелы остается неясным. Ретроспективный анализ дает основания полагать, что внутривенное применение омелы может способствовать продлению периода выживания пациентов, страдающих раком поджелудочной железы. В заключение следует сказать, что это применение является легко осуществимым и безопасным, а его эффективность должна быть оценена путем проведения рандомизированного контролируемого испытания.

Ключевые слова: Рак поджелудочной железы, внутриопухолевый, терапия омелой, Viscum album, эндоскопическая ультрасонография.

Введение

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы имеет не благоприятний прогноз. Хотя по частоте случаев рака он занимает 10-е место, по частоте смертельных случаев по причине рака в Германии и США он находится где-то на 4-6 местах 1,2 . Из-за отсутствия симптомов он остается не обнаруженным, и более 80 % пациентов при постановке диагноза показывают наличие неоперабельной опухоли или распространение метастаз 1 . Единственным способом лечения, который потенциально может привести к выздоровлению, является резекция, однако даже у тех пациентов, у которых она возможна, 5-летний период выживания встречается у менее чем 20 % пациентов — по данным, полученным в многоцентровых исследованиях, и у менее чем 5 % – в когортах пациентов, находящихся под наблюдением 3 . Общий процент выживания у пациентов всех стадий составляет менее 2 % по истечении 5 лет 3,4 .

Для неоперабельных опухолей в 1997 году стандартом стало применение монотерапии гемцитабином, поскольку он показал себя лучше 5-фторурацила по показателям клинической пользы, а также по общему медианному периоду выживания и проценту 1-годичного выживания 5 .Тестированию подвергались многие комбинации гемцитабина с другими терапевтическими агентами, однако никакого существенного увеличения общего периода выживания по сравнению с монотерапией гемцитабином достигнуто не было 6 . Недавние исследования, где применялся гемцитабин в сочетании с эрлотинибом – ингибитором рецептора фактора роста эпидермы 7 , или ФОЛФИРИНОКСОМ 8 , показали значительное увеличение медианного периода выживания, доли пациентов, реагирующих на лечение, а также периода без прогрессирования заболевания, по сравнению с монотерапией гемцитабином. Успех гемцитабина и эрлотиниба все еще тщательно оценивается экспертными комиссиями 9 , а роль этого сочетания в случаях применения для пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы подвергается сомнению в международных директивах 10 . Хотя имеет место повышение токсичности с неблагоприятными реакциями на лекарство степени 3/4, ФОЛФИРИНОКС был принят в качестве лечебного средства первого уровня для пациентов с хорошими показателями моложе 75 лет 11,12 .

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы показывает раннее локальное распространение за пределы анатомических размеров органа, а также лимфогенные и нейрогенные местастазы 3 . Среди клеток редкие опухолевые фибробласты (звездчатые клетки) имеют преимущественно стромальный тип 3, и образуют плотную стромальную ткань из-за сильной десмопластической реакции 14 . Эта строма представляет собой участок ткани, который участвует в формировании рака, образовании опухоли, ее прогрессировании, инвазии и метастазе. Возникающая слабая вакуолизация может являться одной из причин того, что системные виды терапии дают ограниченный эффект 15 . Вследствие этого давно высказывались предположения, что внутриопухолевое введение химиотерапевтических агентов могло бы стать перспективным методом для лечения прогрессирующего рака поджелудочной железы 16 . Теоретической целью было достижение высоких локальных концентраций терапевтических агентов при сведении к минимуму системных побочных эффектов 17 .

Осуществимость локального применения различных агентов была доказана в моделях на мышах 18 . Реакция опухоли описывалась после внутриопухолевой химиотерапии 18 . При внутриопухолевом введении меченых антител наблюдались лучшие результаты в достижении клетки-мишени 20,21 , а после применения к генетически трансформированным линиям раковых клеток были продемонстрированы противоопухолевые эффекты или более высокая чувствительность к химиотерапии 22-26 . Наблюдались также иммунизация после вакцинации дендритными клетками, содержащими опухолевую РНК 27, 28 , а также увеличение периода выживания после вакцинации с химиотерапией 29 . Кроме этого, были проведены успешные исследования на животных (морских свинках), в которых химиотерапевтические агенты вводились внутриопухолево с помощью эндоскопической ультрасонографии 30,31 .

С 2000 года предпринимались попытки применения эндоскопической ультрасонографии для выполнения тонкоигольных инъекций биологических противоопухолевых агентов человеку 32 . В нескольких клинических исследованиях в фазах I и II тестировалось внутриопухолевое применение противораковых агентов для пациентов с прогрессирующей карциномой поджелудочной железы с использованием эндоскопической ультрасонографии для чрескожного трансабдоминального или чресжелудочного доступа, и были показаны осуществимость таких процедур и приемлемый профиль их безопасности 16,17,33-37 .

В исследовании, выполненном Matthes et al.,в котором 14 пациентов, страдающих раком поджелудочной железы, получали внутриопухолевую терапию омелой, была продемонстрирована клиническая польза, выражавшаяся в регрессии опухоли (57 %), стабилизации болезни (36 %) и проценте выживания за 1-годичный период (36 %), при общей хорошей переносимости лечения 38 . В качестве следующего шага в этом ретроспективном исследовании мы проанализировали данные по всем пациентам с неоперабельной или метастазирующей карциномой поджелудочной железы, проходившим лечение в больнице Havelhoehe в Берлине (Германия), или находящимся под наблюдением в амбулаторном лечебном центре, которые получали лечение препаратом омелы при внутриопухолевом введении. Мы документально регистрировали все виды применявшейся терапии и анализировали выживаемость пациентов. Целью этого исследования была оценка эффекта терапии омелой при внутриопухолевом введении и наблюдение за возможными неблагоприятными реакциями на лекарство.

Методы омелотерапиии

С 2004 по 2011 годы данные по наблюдению за всеми пациентами отделения гастроэнтерологии больницы Havelhoehe (Берлин, Германия), которым был поставлен диагноз карцинома поджелудочной железы, и которые дали согласие на проведение внутриопухолевой терапии омелой, регистрировались в Network Oncology 39 . Все связанные с опухолями данные в отношении диагностики и лечения регистрировались с особым акцентированием применения экстрактов омелы. Указывались также традиционные виды терапии, а также любые неблагоприятные явления, документально отраженные в историях болезни пациентов.

Внутриопухолевое введение препаратов омелы выполнялось либо трансабдоминально, либо чресжелудочно/трансдуоденально с применением тонкоигольной техники, направляемой с помощью эндоскопической ультрасонографии. В то время как пациент находился под седативным действием пропофола, опухоль визуализировалась сонографически, и вблизи дальней границы опухоли помещалась игла Chiba (20 G). Препарат омелы вводился фракциями, передвигая иглу к ближней границе опухоли; когда игла вынималась, то вводился 0.9 % NaCl – во избежание обратного истечения препарата омелы из пункционного канала, чтобы уменьшить раздражение брюшины. Каждый раз опухоль подвергалась инъекциям 1-3 раза. По возможности в начале терапии применялась фаза индукции, состоящая из трех инъекций с увеличивающимися дозировками, начиная с 20 мг для препарата Abnoba и 50-100 мг для препарата Helixor.

Каждые 2-3 дня, в зависимости от состояния пациента, находящегося в стационаре, дозировка препарата омелы повышалась. Повышение дозировок составляло 20-40 мг (Abnoba) или 100-200 мг (Helixor) – вплоть до максимальной дозировки примерно 160 мг (Abnoba) или 1400 мг (Helixor). В зависимости от схемы химиотерапии, все дальнейшие инъекции омелы вводились вперемежку с химиотерапией, с интервалами в 4 недели или более, в соответствии с директивами S3 – применение седативных средств в желудочно-кишечной эндоскопии 41 . Во время этой процедуры проводилось наблюдение за кровяным давлением, частотой пульса и насыщением кислородом, а также накладывалась рутинная кислородная носовая маска при скорости течения кислорода1.5-3.1 л/мин. После процедуры за пациентом велось наблюдение в течение как минимум 2 часов. Если требовалось, до или после процедуры пациентам давали обезболивающие (пиритрамид3.25 – 7.5 мг) или противорвотные (например метоклопрамид 10-20 мг).

Последующие анализы и графики выполнялись в R (версия 2.14.1, R Development Core team, 2011). Процент неблагоприятных явлений вычислялся как число таких событий, деленное на общее число инъекций препарата. Мы вычисляли оценки Каплана-Мейера для всей популяции пациентов и для подгрупп UICC на стадиях III и IV, используя функцию survfit, введенную в пакет выживаемости (версия 2.37-2); 95 %-ные доверительные интервалы (CI) вычислялись на логарифмической основе (выживаемость).

Источник

Изучение экстрактов омелы на предмет взаимодействия с растением

Январь 2012 г. Том 26 Издание 1 ISSN 0951-418X

«PHYTOTHERAPY RESEARCH» (Исследования по фитотерапии)

Международный журнал, посвященный клинической и фармакологической оценке растительных лекарственных средств, нутрицевтиков и производных лекарственных средств природного происхождения www.interscience.wiley.com/journal/ptr, перепечатанная статья

Исследование в области фитотерапии для оценки экстрактов омелы (Viscum album) на предмет взаимодействия «растение — лекарственный препарат» посредством ингибирования и индукции активности цитохрома P450

Йоганнес Доймер и Юрген Вейсенбраун

Издательство «WILEY BLACKWELL»

Phytother. Res. 26:11–17 (2012)

Опубликован он-лайн 28 апреля 2011 г. в он он-лайн библиотеке «Wiley»

(wileyonlinelibrary.com) DOI: 10.1002/ptr.3473

Изучение экстрактов омелы (Viscum album) на предмет взаимодействия «растение — лекарственный препарат» посредством ингибирования и индукции активности цитохрома P450

Йоганнес Доэймер 1 и Юрген Айсенбраун 2

1 «БиоПруф АГ», Вайхенстефанер Штрассе 28, 81673 Мюнхен, Германия

2 «АБНОБА ГмбХ», Хоэнцоллернштрассе 16, 75177 Пфорцхайм, Германия

In vitro проводилось испытание трех имеющихся в продаже экстрактов омелы (Viscumalbum L.), выращенной на ясене (абнобаВИСКУМ ® Фраксини 20 мг), на ели (абнобаВИСКУМ ® Абиентис 20 мг) и на сосне (абнобаВИСКУМ ® Пини 20 мг), на предмет их способности влиять на основные цитохромы P450, при участии которых происходит метаболизм лекарственных препаратов, через изменение жизнеспособности гепатоцитов, ингибирование цитохромов P450 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 и 3A4 и через индукцию цитохромов P450, 1A2, 2B6, 2C9, 2E1 и 3A4. Так как три экстракта были получены из растений омелы, принадлежащих к трем различным подвидам Viscumalbum L., они имеют явные отличия в содержании и спектре различных активных ингредиентов, например, специфических лектинов омелы. Цитотоксические эффекты на клетки печени наблюдались у абнобаВИСКУМ ® Фраксини с высоким содержанием лектинов при значении EC₅₀ 2,56 мкг/мл, у абнобаВИСКУМ ® Абиентис с умеренным содержанием лектинов при значении EC₅₀ 5,79 мкг/мл и у абнобаВИСКУМ ® Пини с низким содержанием лектинов при значении EC₅₀ 30,89 мкг/мл. Индукция цитохромов P450 исследовалась на клетках печени человека от трех доноров. Исследование ингибирования цитохромов P450 проводилось на микросомах печени человека. Для всех трех экстрактов не наблюдались вовсе или наблюдались выраженные в незначительной степени индукция и ингибирование. Данные указывают на отсутствие или незначительное потенциальное взаимодействие «растение – лекарственный препарат» посредством влияния на цитохромы P450 любого из трех экстрактов омелы. Авторское право © 2011 Издательство «JohnWiley &Sons, Ltd»

Ключевые слова: экстракт омелы; взаимодействие «растение – лекарственный препарат»; жизнеспособность гепатоцитов; ингибирование цитохрома P450; индукция цитохрома P450.

Введение о омелотерапии

Экстракты омелы (Viscumalbum L.) назначаются в качестве дополнительного лекарственного средства в терапии рака на протяжении более чем 80 лет (Kienle and Kiene, 2010), нередко они назначаются одновременно с различными химиотерапевтическими препаратами. Как и при назначении любого другого растительного препарата, необходимо проявлять бдительность, и основное беспокойство связано с тем, что фармакокинетика и эффективность этих препаратов меняются вследствие ингибирования или индукции цитохромов P450. Классическим примером является зверобой, для которого выраженное изменение фармакокинетических свойств различных лекарственных препаратов вследствие индукции или ингибирования цитохрома P450 было широко описано во многих исследованиях (Mathijssen et al., 2002).

Целью этого исследования было оценивать препараты омелы, абнобаВИСКУМ ® Фраксини, абнобаВИСКУМ ® Абиентис и абнобаВИСКУМ ® Пини, на предмет их способности вмешиваться в метаболизм лекарственных препаратов посредством ингибирования или индукции цитохромов P450, в соответствии с руководствами для скринига invitro на предмет лекарственных взаимодействий (EMEA, 1997; FDA, 2006; BfArM, 2004). Эти три препарата представляют три подвида (ssp.) омелы (Viscumalbum), используемые для производства препаратов абнобаВИСКУМ. Омела с ясеня, используемая для препарата абнобаВИСКУМ Фраксини принадлежит к подвиду Album, Viscumalbum L. Омела, растущая на деревьях ели, принадлежит к подвиду Abientis, Viscumalbum L. Омела с сосны для препаратов абнобаВИСКУМ Пини принадлежит к подвиду Austriacum, Viscumalbum L. Существуют определенные различия между препаратами трех подвидов омелы в содержании и спектре активных ингредиентов, например, лектинов (Scheer et al., 1995). Для того, чтобы выявить все различия в цитотоксичности и потенциале метаболического взаимодействия, проводилась оценка всех трех препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракт омелы. Водные экстракты омелы абнобаВИСКУМ ® Абиентис 20 мг, партия №712 B14; абнобаВИСКУМ ® Фраксини 20 мг, партия №804 A28; и абнобаВИСКУМ ® Пини 20 мг, партия №801B17; были получены от производителя «АБНОБА ГмбХ», Пфорцхайм, Германия. Все три экстракта были произведены в соответствии с Немецкой гомеопатической фармакопеей (правило 32) в виде спрессованного сока и содержат 15 мг экстракта омелы из 20 мг растения омелы. 20 мг — это самая высокая доступная концентрация экстрактов абнобаВИСКУМ.

Гепатоциты человека. Свеже нанесенные человеческие гепатоциты для исследований индукции от трех доноров (3×10 5 клеток на лунку, на планшете на 24 лунки, номера серий: 23206-9706 (донор I); 23226-6721 (донор 2); 23262-8346 (донор 3)) поставлялись компанией «Гепакульт ГмбХ», Регенсбург, Германия.

Микросомы печени человека. Микросомы человеческой печени поставлялись компанией «БД Биосайенсиз», Уобурн, США, в виде объединенных микросом печени человека обоих полов, номер по каталогу 452156, номера партий 18888, 28831, 88114 и 99268. До использования они хранились при температуре -80°C.

Химические реагенты, используемые для MTT-анализа. Среда InVitro Gro HI, номер по каталогу Z99009 «Цельсис ИнВитро ГмбХ», Неусс, Германия; пенициллин/стрептомицин, номер по каталогу P11-010 «ПААЛ Лабораториз ГмбХ», Пашинг, Австрия; дексаметазон, номер по каталогу D9184 «Сигма-Олдрич», Тауфкирхен, Германия; MTT, номер по каталогу A2231, «Апплихем», Дармштадт, Германия; додецилсульфат натрия (SDS), номер по каталогу A2572, «Апплихем», Дармштадт, Германия; N,N-диметилформамид, номер по каталогу A3725, «Апплихем», Дармштадт, Германия; уксусная кислота, номер по каталогу 49199, «Флука»/«Сигма-Олдрич», Тауфкирхен, Германия; фосфатный буферный раствор (PBS), номер по каталогу VX10010015 «Инвитроген ГмбХ», Карлсруэ, Германия; этанол, номер по каталогу 1.00983 «Мерк», Дармштадт, Германия; натрия фторид, норме партии B481 «Мерк», Дармштадт, Германия.

Химические реагенты, используемые в исследованиях ингибирования

Аммония ацетат p.a., номер по каталогу 49638, «Флука», («Сигма-Олдрич»), Тауфкирхен, Германия; MgCl₂ , номер по каталогу 63063 «Флука», Бухз, Швейцария; калий-фосфатный буфер, 0,5M, pH 7,4, номер по каталогу 451201, и тетранатриевая соль b-НАДФ-H, номер по каталогу A1395, «БД Биосайенсиз», Хайдельберг, Германия; ацетонитрил, номер по каталогу 01207802LC/MS «АпплиХем ГмбХ», Дармштадт, Германия; муравьиная кислота, ULC/MS, номер по каталогу 06914131, изопропанол, ULC/MS, номер по каталогу 16264102, метанол, абсолютный LC/MS, номер по каталогу 13687082, вода,ULC/MS, номер по каталогу 23214125, «Биосолв», Валкенсваард, Нидерланды.

Химические реагенты, используемые в исследованиях индукции. Среда InVitro Gro HI, номер по каталогу Z99009, «Цельсис ИнВитро ГмбХ», Неусс, Германия; пенициллин/стрептомицин, номер по каталогу P11-010 «ПААЛ Лабораториз ГмбХ», Пашинг, Австрия; дексаметазон, номер по каталогу D9184, ДМСО, номер по каталогу 472301, салициламид, номер по каталогу 86,041-7, и буферный раствор Кребса-Хемзелайта, номер по каталогу K3753 «Сигма-Олдрич», Тауфкирхен, Германия; этанол, номер по каталогу 000983 «Мерк»; ацетонитрил, LC/MS номер по каталогу 01207802, муравьиная кислота, ULC/MS, номер по каталогу 06914131, и метанол, абсолютный LC/MS, номер по каталогу 13687082, «Биосолв», Валкенсваард, Нидерланды; эмбриональная телячья сыворотка, номер по каталогу10270-106, «Инвитроген ГмбХ», Карлсруэ, Германия.

Вещества-маркеры, метаболиты и внутренние стандарты. Фенацетин, содержание 99,4 % номер партии S32704, «Флука»; ацетаминофен, содержание 99,9 %, номер партии 115K0098, «Сигма-Олдрич»; ацетаминофен-d4, содержание 98,0%, партия №8-SSR44-1, «TRC»; кумарин, содержание 100,0 %, серия № 056K1129, «Сигма»; 7OH-кумарин, содержание 98,7 %, S34889, «Олдрич»; бупропион HCl, содержание 98,0 %, номер партии 31677-93-7, «TRC»; OH-бупропион, содержание 98,0 %, партия №00081, BD; OH-бупропион-d₆, содержание 98,0 %, партия №78308, BD; паклитаксел, содержание 99,2 %, номер партии HOG193 USP; 6α-OH-паклитаксел, содержание 98,0 %, номер партии 3-JQW-112-9, «TRC»; доцетаксел, содержание 99,3 %, номер партии 1343815, «Флука»; диклофенака натриевая соль, содержание 99 %, номер партии 075K1896, «Сигма»; 4-OH-диклофенак-13C6, содержание 97 %, номер партии 17879, BD; S-мефенитоин, содержание 99,0 %, партия №2-RCD-56-4, «TRC»; 4-OH-мефенитоин, содержание 99,8 %, номер партии 065K3251, «Сигма»; 4-OH-mephenytoin-d₃, содержание 99,0 %, номер партии 065K3251, BD; буфуралола гидрохлорид, содержание 97 %, номер партии 6-JWA-170-2, «TRC»; 1-OH-буфуралола малеат, содержание 99 %, номер партии 15537 BD; 1-OH-буфуралол-малеат-d9, содержание 98 %, партия №18657, BD; хлорзоксазон, содержание 100 %, номер партии 1027K1562, «Сигма»; OH-хлорзоксазон, содержание 97,0 %, номер партии 08778 BD; тестостерон, содержание 99,4 %, партия №2099, Ридель де Хайен; 6b-OH-тестостерон, содержание 99,0 %, партия №51730, BD; 6b-OH-тестостерон d₇, содержание 99,0 %, номер партии 64732, BD.

Референтные ингибиторы. Фурафиллин, содержание: 99 %, номер партии 98451, BD; 8-метоксипсоралин, содержание: 100 %, номер партии 067K1469, «Сигма»; триэтилентиофосфамид, содержание: 99,1 %, партия номер 107K1444, «Сигма»; кверцетин, содержание: 99 %, номер партии 087K0744, «Сигма»; сульфафеназол, содержание: 99 %, номер партии 056K1246, «Сигма»; омепразол, содержание: 99,9 %, номер партии 086K1405, «Сигма»; хинидин, содержание: 87 %, номер партии 026K1021, «Сигма»; диэтилдитиокарбамат, содержание: 101,2 %, номер партии 1359427, «Сигма»; кетоконазол, содержание: 99 %, номер партии 121H0524, «Сигма».

Референтные индукторы. Рифампицин, содержание: 98 %, партия номер 087K1875, «Сигма»; омепразол, содержание: 99,9 %, партия номер 086K1405, «Сигма»; фенобарбитал, содержание: 100 %, партия номер EPP0900000, «LGC»; этанол, содержание: 100 %, партия номер K38345783, «Мерк».

Исследование цитотоксичности с помощью (MTT-теста). Влияние препаратов омелы на жизнеспособность гепатоцитов оценивалось для того, чтобы установить максимальную концентрацию экстракта, которую можно было бы испытывать без прямого цитотоксического эффекта. Для этой цели использовался MTT- тест (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид). Свеже нанесенные человеческие гепатоциты, взятые у лиц мужского пола засевают в 96-луночные плоскодонные планшеты с плотностью клеток 10 5 на лунку и инкубируют с препаратами омелы при 37°С и влажности 95 % в атмосфере 5% СО2 в течение 48 ч., с заменой питательной среды через 24 часа, в диапазоне концентраций 0,002 – 2000 мкг/мл (конечная концентрация) на 100 мкл питательной среды. Контролем служат интактные клетки печени, адаптированными к питательной среде (среда «InVitro Gro HI», «Цельсис ИнВитро ГмбХ», Неусс, Германия), содержащей 1% (об./об.) пенициллин/стрептомицин и 0,05 % (об./об.) базового раствора дексаметазона (100 мкМ дексаметазона в этаноле), инкубированные в тех же условиях, но без препаратов.

Контроль путем проведения микроскопического исследования показал отсутствие преципитатов при культивировании, за исключением культивирования при концентрации 2000 мкг/мл. Все испытуемые концентрации исследовались в виде 8-кратных повторений. Инкубация менялась в зависимости от рабочего раствора MTT в течение 1,5 ч. Рабочим раствором MTT были 2,5 мл базового раствора (5 мг/мл в PBS) + 7,5 мл среды для культивирования гепатоцитов. Превращение соли тетразолия (MTT) в формазан жизнеспособными клетками определялось фотометрически при длине волны 570 нм после лизиса клеток путем встряхивания в лизирующей буфере. Лизирующий буфер состоит из 39 % (об./об.) воды, 39% (об./об.) диметилформамида, 2 % (об./об.) уксусной кислоты, 20 % (м./об.) SDS. Выживаемость клеток определялась как процентная доля сигнала от отрицательного контроля без объекта испытания. Натрия фторид в концентрации 250 мкг/мл служил положительным контролем.

Ингибирование цитохрома P450. Испытывались препараты омелы, в концентрациях 0,2, 2,0 и 200 мкг/мл, с объединенными микросомами человеческой печени (0,5 мгмикросомального белка/мл) в 10 мМ калий-фосфатном буфере при pH 7,4 на предмет на активности цитохромов (CYP) 1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 и 3A4 посредством определенных маркерных реакций в присутствии 3 мМ магния хлорида и 2 мМ НАДФ-H на титрационном микропланшете на 96 лунок при температуре 37±0,5°C. Культивирование проводилось в трех экземплярах. Общий объем отдельной клеточной культуры составлял 240 мкл. Концентрации веществ-маркеров в смесях для культивирования выбирались близко к значению кажущейся K_m. Экстракт омелы или CYP-специфический ингибитор предварительно инкубировались с микросомальной суспензией в течение 5 –10 мин. Культивирование начиналось путем добавления соответствующего вещества-маркера. Культивирование прекращалось через 30 ± 1 мин, так как скорость образования всех исследуемых метаболитов носила линейный характер во времени до 30 мин. Путем забора пипеткой 200 мкл смеси для культивирования переносили в виалу, содержащую 200 мкл ледяного ацетонитрила в качестве стоп-реагента. Образцы центрифугировались при ускорении 3000 × g (центробежное ускорение) в течение 10 мин при температуре 4°C. Затем надосадочная жидкость (супернатант) переносилась на титрационный микропланшет на 96 лунок для тандемной ВЭЖХ-масс-спектроскопии для анализа и определения остаточных веществ-маркеров и образующихся в результате метаболитов.

Образцы, в которые добавлялись известные количества веществ-маркеров и метаболитов-маркеров, использовались для построения калибровочных кривых для того, чтобы количественно определить вещества и метаболиты. Образцы культур, не содержащие объекта исследования и специфического ингибитора CYP, но имеющие идентичные концентрации соответствующего вида растворителя культур объектов исследования, служили в качестве отрицательных контролей ингибирования (ОК). Образцы культур, содержащие CYP-специфический ингибитор, использовались в качестве положительных контролей (ПК) ингибирования. Конечные концентрации веществ-маркеров в отдельной среде для культивирования были следующими: 2 мМ фенацетина для CYP1A2; 2 мМ кумарина для CYP2A6; 40 мМ бупропиона для CYP2B6; 4 мМ паклитаксела для CYP2C8; 4 мМ диклофенака для CYP2C9; 20мМ S-мефенитоина для CYP2C19; 8 мМ буфуралола для CYP2D6; 2 мМ хлорзоксазона для CYP2E1; 40 мМ тестостерона для CYP3A4. Определяемыми метаболитами были ацетаминофен для CYP1A2; умбеллиферон для CYP2A6; гидроксибупропион для CYP2B6, 6α-гидрокси-паклитаксел для CYP2C8, 4′-гидрокси-диклофенак для CYP2C9, 4′-гидроксимефенитоин для CYP2C19, гидроксибуфуралол для CYP2D6, 6′-гидроксихлороксазон для CYP2E1 и 6b-гидрокситестостерон для CYP3A4. Концентрации специфических ингибиторов CYP в образцах культур были следующими: 10 мкМ фурафиллина для CYP1A2; 0,3 мкМ 8-метоксипсорален для CYP2A6; 30 мкМ триэтилентиофосфамида для CYP2B6; 1 мМ кверцетина для CYP2C8; 0,8 мкМ сульфафеназол для CYP2C9; 3 мМ омепразола для CYP2C19; 120 мкМ хинидина для CYP2D6; 1,2 мМ натриевая соль диэтилдитиокарбаминовой кислоты для CYP2E1; 60 мкМ кетоконазола для CYP3A4 (FDA, 2006).

Индукция цитохрома P450. Препараты омелы испытывались на предмет индукции цитохрома Р450 (CYP) в первичных культурах свежевыделенных человеческих гепатоцитов от трех отдельных доноров. Гепатоциты высеивались в 24-луночные планшеты с плотностью клеток 3×10 5 на лунку. Три препарата омелы были в концентрациях 0,2, 2,0 и 4 мкг/мл. Потенциал индукции разных экстрактов в отношении изоферментов CYP 1A2, 2B6, 2C9, 2E1 и 3A4 определялся по соответствующим веществам-маркерам, как описано выше для ингибирования цитохрома Р450 (CYP), в сравнении с референтными индукторами. Культуры, содержащие референтные индукторы для CYP1A2 (омепразол, 50 мкМ), CYP2B6 (фенобарбитал, 1 мМ), CYP2C9 (рифампицин, 10 мкМ), CYP2E1 (этанол, 100 мМ) и CYP3A4 (рифампицин, 10 мкМ), соответственно, выступали в качестве референтных контролей индукции. Были исследованы по три повторения на каждый референтный контроль. После 48-часового равновесия гепатоцитов при температуре 37°C в питательной среде для гепатоцитов, препараты омелы и референтные индукторы добавлялись к гепатоцитам в течение 72 ч с обновлением среды и реагентов для испытаний каждые 24 часа. За 72-часовым периодом индукции следовала 3-часовая инкубация гепатоцитов с веществами-маркерами. Реакции прекращались путем забора надосадочной жидкости и перемешивания с равным объемом ледяного ацетонитрила, за которым следовало центрифугирование для преципитации протеинов при температуре 4°C. Полученная в результате надосадочная жидкость использовалась для тандемной ВЭЖХ масс-спектроскопии для обнаружения и определения метаболитов.

Тандемная ВЭЖХ масс-спектроскопия. Разделение и обнаружение веществ-маркеров и метаболитов-маркеров достигается при использовании ВЭЖХ («Waters Alliance 2705», Эшборн, Германия) и масс-спектроскопии («Quatro LC», Micromass, Витеншэйв, Великобритания) на колонке C18 («Симметрия», 3,5 мкм, 4,6 × 75 мм, «Waters», Эшборн, Германия) с использованием C18-предколонки («Феноменекс», 4×3 мм, Ашафенбург, Германия). Параметры ВЭЖХ показаны в Таблице 1, параметры МС – в Таблице 2.

Источник