ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА
Возможности защиты от различных инфекционных заболеваний изучаются с давних времен. В древнем Китае, например, люди, с большим риском для жизни, втягивали в нос высушенные и измельченные корочки оспенных больных . Начало научному подходу к активной иммунизации было положено в XVIII веке Эдвардом Дженнером, именно он стал вакцинировать людей коровьей оспой, чтобы защитить их от натуральной оспы. В 1777 г. он основал в Лондоне первый в мире оспо-прививальный пункт. 100 лет спустя Луи Пастером была произведена первая успешная вакцинация человека против бешенства. Позднее последователи Пастера разработали методы специфической иммунизации для профилактики инфекционных болезней. Все это оказалось возможным благодаря предложенной Пастером методики аттенуации возбудителей — снижения их вирулентности (способности вызывать болезненные изменения) на специальных средах. В 1887 г. в Париже открывают институт вакцин и сывороток, который носит имя выдающегося ученого Луи Пастера. В 1888 г. правительство России оказывает институту материальную и интеллектуальную поддержку в лице таких выдающихся ученых, как И. И. Мечников, Н. Ф. Гамалея, Д. К. Заболотный, Г. Н. Габричевский, Л. А. Тарасевич, А. М. Безредка, М. Вайн-берг, Е. Вольман. В 1880—1888 гг. в России были созданы первые в мире антирабические станции, где проводилась профилактика бешенства. В 1880-х г. ученый Л. С. Ценковский создал первую отечественную вакцину против сибирской язвы, которая использовалась вплоть до 1942 г. В 1920 г. под руководством Н. Ф. Гамалеи в России была усовершенствована антирабическая вакцина. В 1930-х г. в нашей стране работает целая сеть институтов противоэпидемического профиля под руководством Н. Ф. Гамалеи, Л.А.Тарасевича, Д. К. Заболотного, Г. Н. Габричевского. Эра развития вакцинопрофилактики продолжается выдающимися открытиями вакцины против полиомиелита (М. П. Чумаков и А. А. Смородинцев), туляремии (Н. А. Гайский, Б. Я. Эльберт), коклюша, дифтерии, столбняка (М. С. Захарова), сибирской язвы (Н. Н. Гинзбург), сыпного тифа (М. М. Маевский, М. К. Кронтовская), бруцеллеза (П. А. Вершилова). В институте эпидемиологии и микробиологии им. Л. Пастера в Санкт-Петербурге создается собственная научная школа — исследователи под руководством академика А. А. Смородинцева получают живые вирусные вакцины. Начинается массовая вакцинопрофилактика инфекций в СССР. К концу XX века появилась возможность предотвращать развитие более 40 инфекционных заболеваний. В настоящее время в мире производится более 100 различных вакцин. С каждым годом их ассортимент расширяется, интенсивно разрабатываются комбинированные препараты, позволяющие за одну инъекцию вводить 5—6 и более вакцин. Ведутся разработки в области изменения способов введения вакцин.
ВАКЦИНАЦИЯ – ЗАЛОГ ЗДОРОВОГО БУДУЩЕГО
Ежегодно в мире от инфекционных заболеваний погибают около 12 миллионов детей. Третья часть из них (4 миллиона) умирают от болезней, которые можно было предотвратить с помощью прививки. В XIX веке диагноз «корь», «дифтерия», «бешенство», «столбняк», считались смертным приговором. Начиная с XX века, благодаря достижениям в области микробиологии, вирусологии и фармакологии заболеваемость этими инфекциями сведена практически к нулю. Целью иммунизации является формирование специфического иммунитета к инфекционному заболеванию посредством искусственного создания инфекционного процесса, который в большинстве случаев протекает бессимптомно или в легкой форме (у непривитого человека течение этих болезней несет тяжелейший характер, иногда с летальным исходом).
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ВАКЦИНЫ
В ответ на вакцинацию в организме возникает цепочка иммунологических реакций, подразделяющихся на три периода. Первый период (латентный, или «лаг-фаза») продолжается с момента введения вакцины до появления первых антител в крови. Длительность первого, латентного, периода варьирует от нескольких дней до 2 недель и зависит от вида вакцины, способа ее введения и особенностей иммунной системы организма. Второй период характеризуется повышением концентрации специфических антител в крови. После введения некоторых вакцин специфические антитела появляются очень быстро, содержание их в крови стремительно повышается, что позволяет использовать эти вакцинные препараты для экстренной профилактики при контакте с больными корью, полиомиелитом, эпидемическим паротитом и другими инфекциями. Второй период продолжается от 4 дней до 4 недель. Третий период наступает после достижения максимального уровня специфических антител, когда их количество начинает уменьшаться — вначале быстро, затем медленно. Такое уменьшение происходит в течение нескольких лет. При повторной встрече с антигеном (при ревакцинации или инфицировании привитого ребенка) «лаг-фаза» отсутствует, так как активируются В-клетки памяти и специфический иммунный ответ возникает быстрее и отличается большей интенсивностью.
ПОМНИТЕ, ПРИВИВКИ СПАСАЮТ ВАШЕ ЗДОРОВЬЕ И ЖИЗНЬ!
Сегодня у каждого человека имеется уникальная возможность защитить себя от тяжелых заболеваний простой и доступной манипуляцией – вакцинацией . Не упустите шанс быть здоровым! Для защиты населения от опасных инфекционных заболеваний введен Национальный календарь профилактических прививок. В этом Календаре указаны инфекционные заболевания, сроки и возраст в котором проводится вакцинация. В некоторых случаях, при выявлении каких-либо индивидуальных особенностей организма специалист составляет индивидуальный план обследования, подготовки к вакцинации и непосредственной вакцинации пациента.
Живые вакцины — производят из живых микроорганизмов с пониженной вирулентностью. Большинство таких вакцин способствуют выработке длительно сохраняющегося на высоком уровне иммунитета . Живыми являются вакцины против гриппа, кори, эпидемического паротита, желтой лихорадки и др. Инактивированные (убитые) вакцины — получают путем полного обезвреживания бактерий и вирусов с сохранением их иммуногенных свойств. Различают цельноклеточные, субъединичные, рекомбинантные вакцины и сплит-вакцины. Цельноклеточные (цельновирионные) вакцины — приготовляют путем лиофилизированного высушивания (при низкой температуре в условиях вакуума), нагревания или обработки химическими веществами (формалином, формальдегидом). К ним относятся вакцины против коклюша (АКДС), гриппа, вирусного гепатита А, клещевого энцефалита, холеры, и др. Субъединичные вакцины — содержат только поверхностные антигены, что позволяет уменьшить в вакцине содержание белка и, следовательно, снизить ее аллергенность. К субъединичным вакцинам относятся вакцины против гриппа, пневмококковой, менингококковой, гемофильной инфекций, и др. Сплит-вакцины — изготавливают из разрушенных вирусов. Они содержат фрагментированные и очищенные частицы, в том числе поверхностные белки и другие компоненты вирусов. В эту группу входят вакцины против гриппа и др. Рекомбинантные вакцины — относятся к новому поколению иммунных препаратов, произведенных посредством встраивания антигена вируса в геном дрожжевых клеток. Представителем данной группы является вакцина против вирусного гепатита В. Анатоксины — изготавливают из экзотоксинов (токсинов, выделяемых возбудителями). Они легко дозируются и комбинируются с другими вакцинами. При введении анатоксинов вырабатывается антитоксический иммунитет. Используют дифтерийный, столбнячный, стафилококковый анатоксины, а также анатоксины против ботулизма и газовой гангрены. Так же по составу вакцины делятся на: Моновакцины (содержащие один антиген), Ассоциированные, или комбинированные (имеющие несколько антигенов) вакцины, Поливалентные вакцины (состоящие из различных штаммов одного вида микроорганизмов). Любая вакцина содержит вспомогательные вещества: адсорбенты, консерванты, эмульгаторы, индикаторы рН, стабилизаторы. Адсорбенты (адъюванты) — нерастворимые соли алюминия (фосфат или гидроокись), усиливающие действие вакцины и, следовательно, значительно увеличивающие силу иммунного ответа. Иногда в качестве адсорбентов используются транспортные белки (они входят в состав дифтерийного, столбнячного анатоксинов). Консерванты подавляют размножение «посторонних» микроорганизмов. Для этой цели используют тиомерсал (мертиолят), формальдегид, феноксиэтанол, фенол и антибиотики (неомицин, гентамицин, полимиксин). Содержание консервантов в вакцинах настолько низкое, что не представляют какой-либо опасности для человека. Эмульгаторы добавляют для улучшения растворения сухих вакцин. В качестве стабилизаторов используют декстран, сахарозу, сорбит, желатин, альбумин. В качестве индикатора рН часто используют метиловый красный. Можно сразу обнаружить «сдвиг» показателя кислотности по изменению цвета препарата и забраковать вакцину.
Эффективность вакцин входящих в Национальный календарь профилактических прививок подтверждается следующими показателями: Невосприимчивыми становятся К полиомиелиту — 95% привитых; К дифтерии — 95% привитых; К столбняку — 95% привитых; К кори — 98% привитых; К эпидемическому паротиту — 90% привитых; К краснухе — 100% привитых; К гепатиту В — 84-98% привитых (в зависимости от возраста); К коклюшу — 80-90% привитых; К туберкулезу — 70-85% привитых детей, практически полностью защищая их от генерализованных форм инфекции (диссеминированный туберкулез, туберкулезный менингит).
Гарантированно говорить о полной безопасности вакцины не имеет смысла, так как нельзя говорить о полной безопасности любого даже самого безобидного препарата . Но гарантированно можно говорить о следующем:
1. Все серии вакцин проверяются непосредственно на производстве и в отделе контроля качества предприятия. Кроме того, они проходят контроль по производственным протоколам и выборочный лабораторный контроль в Национальном органе контроля — ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Такая тройная экспертиза обеспечивает надлежащее качество выпускаемых серий вакцин.
2. Все вакцины обладают определенной степенью реактогенности, которая лимитирована нормативной документацией на препараты.
3. В соответствии с Законом Российской Федерации “О лекарственных средствах”, утвержденным 22 июня 1998 г, производство лекарственных средств, к которым относятся и иммунобиологические препараты, осуществляется предприятиями-производителями лекарственных средств, имеющими лицензию на их производство”.
4. В России на 16 предприятиях производится 50 видов вакцин против 28 инфекционных заболеваний. Практически все вакцины соответствуют по основным показателям безопасности и эффективности требованиям.
Вакцинацию можно проводить следующими способами:
— орально — дозу вакцины закапывают в рот . После прививки в течение часа не разрешается прием пищи и жидкости.;
— интраназально — препараты впрыскивают в носовые ходы, что способствует выработке не только общего, но и местного иммунитета.;
— накожно (скарификационная вакцинация) оптимальна при иммунизации живыми вакцинами против особо опасных инфекций (чумы, туляремии и др.). Вакцины наносят на наружную поверхность плеча, а затем сухим оспопрививочным пером делают насечки через каплю.;
— внутрикожно — введение вакцины осуществляется в области наружной поверхности плеча (живая вакцина против туберкулеза (БЦЖ)).;
— подкожно — вакцинация используется для введения некоторых живых вакцин (коревой, паротитной и др.). Инъекцию делают в подлопаточную область или область наружной поверхности плеча.;
— внутримышечно — вакцинация в основном используется для введения инактивированных вакцин, так как местная реакция при данном способе иммунизации менее выражена. Детям в возрасте до 3 лет вакцины рекомендуется вводить в переднебоковую часть бедра, детям старше 3 лет, подросткам и взрослым — в область дельтовидной мышцы плеча.
ОДНОВРЕМЕННОЕ ВВЕДЕНИЕ НЕСКОЛЬКИХ ВАКЦИН
Согласно Приказу Минздрава РФ № 229 от 27.06.2001 г. возможности одномоментной вакцинации с использованием любых сочетаний нескольких вакцин значительно расширились . Возникает обоснованный вопрос, какова реакция организма на такой способ вакцинации? Наш организм постоянно сталкивается с огромным числом инфекционных возбудителей и на каждый из них вырабатывает антитела определенного вида, поэтому при одновременном введении нескольких вакцин, число антител начинает расти в геометрической пропорции, без угнетения иммунитета. Таким образом, количество вакцин, которое можно ввести ребенку одновременно без всякого ущерба для его иммунитета, не ограничено, к тому же при сочетанной иммунизации сокращается частота реакций и побочных эффектов. На сегодняшний день перед ВОЗ стоит задача создания комбинированной вакцины, которая могла бы защитить от 25—30 инфекций, вводилась бы однократно внутрь, в самом раннем возрасте, и не вызывала бы побочных явлений.
Источник
Иммунологические методы исследования в лабораторной практике
Преимущества иммунологического метода исследования.
Серологические реакции различаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет lgM-антитела, но менее чувствительна для определения lgG-антител. Реакции связывания комплемента и гемолиза, которые требуют участия комплемента, не выявляют антитела, не присоединяющие комплемент, например lgA-антитела и lgE-антитела. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против антигенных детерминант поверхности вириона, связанных с патогенностью. Чувствительность иммунулогических методов превосходит все другие методы исследования антигенов и антител, в частности радиоиммунный и иммуноферментный анализы позволяют улавливать присутствие белка в количествах, измеряемых в нанограммах и даже в пикограммах.
С помощью предложенного способа определяют группу и проверяют безопасность крови (гепатит В и ВИЧ-инфекция). При трансплантации тканей и органов, иммунологический метод позволяет определять совместимость тканей и тестировать методы подавления несовместимости. В судебной медицине используют реакцию Кастеллани для определения видовой специфичности белка и реакцию агглютинации для определения группы крови.
Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Этиологию заболевания устанавливают также на основании прироста антител к возбудителю в сыворотке крови реконвалесцента по сравнению с пробой, взятой в первые дни болезни. На основе исследования изучают иммунитет населения по отношению к массовым инфекциям, например к гриппу, а также оценивают эффективность профилактических прививок.
Развитию иммунологических методов способствовало создание моноклональных антител, продуцируемых гибридомой, полученной в результате слияния иммунокомпетентной клетки В-лимфоцита и клетки миеломы мышей. Моноклональные антитела несут только одну химически однородную популяцию антител, комплементарную специфической детерминанте антигена, что позволяет осуществлять тонкую дифференциацию белков. Развитие иммунологического метода исследования идет как по линии совершенствования реагентов (чистоты антигенов и антител), так и по линии создания автоматизированных систем постановки реакций и их инструментального учета.
Виды реакций метода иммунологического исследования.
В зависимости от их механизма и учета результатов, иммунологический метод исследования можно подразделить на 5 видов реакции.
1.Реакции, основанные на феномене агглютинации.
Агглютинация представляет собой склеивание клеток или отдельных частичек — носителей антигена с помощью иммунной сыворотки к этому антигену.
Реакция агглютинации бактерий с использованием соответствующей антибактериальной сыворотки относится к наиболее простым серологическим реакциям. Взвесь бактерий добавляют к различным разведениям испытуемой сыворотки крови и через определенное время контакта при t 37° регистрируют, при каком наивысшем разведении сыворотки крови происходит агглютинация. Реакцию агглютинации бактерий используют для диагностики многих инфекционных болезней: бруцеллеза, туляремии, брюшного тифа и паратифов, бациллярной дизентерии, сыпного тифа.
Реакции агглютинации для определения группы крови и резус-фактора основаны на взаимодействии аллоантител (изоантител) и антигенов эритроцитов. Антитела против резус-фактора являются неполными, они не способны к прямой реакции с резус-положительными эритроцитами, поэтому для их обнаружения используют реакцию Кумбса, основанную на выявлении неполных антител с помощью антиглобулиновых сывороток. К эритроцитам известной специфичности добавляют исследуемую сыворотку крови, а вслед за этим антиглобулиновую сыворотку против lgG (непрямая реакция Кумбса). Fab-фрагменты неполных антител исследуемой сыворотки крови присоединяются к эритроцитам, а к свободным Fc-фрагментам этих антител присоединяются антитела против lgG, и происходит агглютинация эритроцитов.
Реакция пассивной или непрямой гемагглютинации (РПГА, РНГА). В ней используют эритроциты или нейтральные синтетические материалы (например, частицы латекса), на поверхности которых сорбированы антигены (бактериальные, вирусные, тканевые) или антитела. Их агглютинация происходит при добавлении соответствующих сывороток или антигенов. Эритроциты, сенсибилизированные антигенами, называют антигенным эритроцитарным диагностикумом и используют для выявления и титрования антител. Эритроциты, сенсибилизированные антителами, называют иммуноглобулиновыми эритроцитарными диагностикумами и применяют для выявления антигенов.
Реакцию пассивной гемагглютинации используют для диагностики заболеваний, вызванных бактериями (брюшной тиф и паратифы, дизентерия, бруцеллез, чума, холера и др.), простейшими (малярия) и вирусами (грипп, аденовирусные инфекции, вирусный гепатит В, корь, клещевой энцефалит, крымская геморрагическая лихорадка и др.), а также для определения некоторых гормонов, выявления повышенной чувствительности больного к лекарственным препаратам и гормонам, например пенициллину и инсулину.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на феномене предотвращения (торможения) иммунной сыворотки гемагглютинации эритроцитов вирусами, используется для выявления и титрования противовирусных антител. Она служит основным методом серодиагностики гриппа, кори, краснухи, эпидемического паротита, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций, возбудители которых обладают гемагглютинирующими свойствами, например, для серодиагностики клещевого энцефалита, в лунки панели разливают двукратные разведения сыворотки больного на щелочном боратном буферном растворе. Затем добавляют определенное количество, обычно 8 АЕ (агглютинирующих единиц), антигена клещевого энцефалита и после 18 ч экспозиции при t 4° вносят взвесь гусиных эритроцитов, приготовленную на кислом фосфатно-буферном растворе. Если в сыворотке крови больного есть антитела к вирусу клещевого энцефалита, то антиген нейтрализуется и агглютинация эритроцитов не происходит.
2.Реакции, основанные на феномене преципитации.
Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлоню, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлетрофорез), которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии, в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы — полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген-антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител.
Для постановки двойной иммунодиффузии наливают слой растопленного геля на стеклянную пластинку и после затвердевания вырезают лунки диаметром 1,5–3 мм. В расположенные по кругу лунки помещают исследуемые антигены, а в центральную лунку — иммунную сыворотку известной специфичности. Диффундируя навстречу друг другу, гомологичные сыворотки и антигены образуют преципитат.
При радиальной иммунодиффузии (по методу Манчини), иммунную сыворотку вносят в агар. Антиген, помещенный в лунки, диффундирует через агар, и в результате преципитации с иммунной сывороткой, вокруг лунок образуются непрозрачные кольца, внешний диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод используют для определения классов иммуноглобулинов, а модификации метода можно применять для определения противомикробных антител, относящихся к различным классам иммуноглобулинов.
Иммуноэлектрофорез основан на усилении миграции в геле антигенов и антител путем помещения пластины геля с реагентами в электрическое поле. При этом достигается разделение антигенов и антител на компоненты в соответствии с их подвижностью и зарядом.
Разновидностью иммуноэлектрофореза является радиоиммунофорез. В этом случае после электрофоретического разделения антигенов в канавку, вырезанную параллельно движению антигенов в геле, наливают сначала меченную радиоактивным йодом иммунную сыворотку против определяемых антигенов, а затем иммунную сыворотку против lgG-антител, которая преципитирует образовавшиеся комплексы антитела с антигеном. Все несвязавшиеся реагенты вымывают, а комплекс антиген-антитело обнаруживает методом авторадиографии.
3.Реакции с участием комплемента.
В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки, основанную на способности субкомпонента комплемента Clq и затем других компонентов комплемента присоединяться к иммунным комплексам.
Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет титровать антигены или антитела по степени фиксации комплемента комплексом антиген-антитело. Эта реакция состоит из двух фаз: взаимодействия антигена с испытуемой сывороткой крови (исследуемая система) и взаимодействия гемолитической сыворотки с эритроцитами барана (индикаторная система). При положительной реакции в исследуемой системе происходит связывание комплемента, и тогда при добавлении сенсибилизированных антителами эритроцитов, гемолиза не наблюдается. Реакцию применяют для серодиагностики сифилиса (реакция Вассермана), вирусных и бактериальных инфекций.
Реакция радиального гемолиза эритроцитов может протекать в геле. Взвесь эритроцитов барана помещают в агарозный гель с комплементом; в застывшем на стекле слое делают лунки и вносят в них гемолитическую сыворотку. Вокруг лунок в результате радиальной диффузии антител образуется зона гемолиза, радиус которой прямо пропорционален титру сыворотки. Если сорбировать на эритроцитах какой-либо антиген, например гликопротеиновый гемагглютинин вируса гриппа, краснухи или клещевого энцефалита, то можно воспроизвести феномен гемолиза иммунными сыворотками к этим вирусам. Реакцию радиального гемолиза в геле применяют в диагностике вирусных инфекций. Она характеризуется простотой постановки, нечувствительностью к сывороточным ингибиторам, позволяет титровать сыворотки крови по диаметру зоны гемолиза, не прибегая к серийным разведениям.
Иммунное прилипание. Эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови имеют на поверхности рецепторы к третьему компоненту комплемента (СЗ). Если к антигену (бактериям, вирусам и др.) добавить соответствующую иммунную сыворотку и комплемент, то образуется комплекс антиген-антитело, покрытый СЗ-компонентом комплемента. Эту реакцию применяют при изучении ряда вирусных инфекций (клещевого энцефалита, денге), которые сопровождаются иммунопатологическими процессами и циркуляцией в крови вирусных антигенов в комплексе с антителами.
Основана на способности антител нейтрализовать некоторые специфические функции макромолекулярных или растворимых антигенов, например активность ферментов, токсины бактерий, болезнетворность вирусов. В бактериологии эту реакцию используют для обнаружения антистрептолизинов, антистрептокиназы и антистафилолизинов. Реакцию нейтрализации токсинов можно оценивать по биологическому эффекту, так, например, титруют антистолбнячные и антиботулинические сыворотки. Смесь токсина с антисывороткой, введенная животным, не вызывает их гибели. Различные варианты реакции нейтрализации применяют в вирусологии. При смешивании вирусов с соответствующей антисывороткой и введении этой смеси животным или в клеточные культуры, патогенность вирусов нейтрализуется и при этом животные не заболевают, а клетки культур не подвергаются деструкции.
5.Реакции с использованием химических и физических меток (ИФА).
Иммунофлюоресценция заключается в использовании меченых флюорохромом антител, точнее, иммуноглобулиновой фракции антител lgG. Меченое флюорохромом антитело образует с антигеном комплекс антиген-антитело, который становится доступным наблюдению под микроскопом в УФ-лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Реакцию прямой иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так, для диагностики бешенства, отпечатки кусочков мозга животных, подозреваемых на вирусоносительство, обрабатывают люминесцирующей антирабической сывороткой. При положительном результате, в цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки ярко-зеленого цвета. На обнаружении антигенов вирусов в клетках отпечатков со слизистой оболочки носа основана экспресс-диагностика гриппа, парагриппа и аденовирусной инфекции.
Более широко применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, основанный на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью люминесцирующей иммунной сыворотки против lgG-антител и используемой для обнаружения не только антигенов, но и титрования антител. Метод нашел применение в серодиагностике герпеса, цитомегалии, лихорадки Ласса. Препараты с наслоенной исследуемой сывороткой крови помещают в термостат при t 37° для образования иммунных комплексов, а затем, после отмывания несвязавшихся реагентов, выявляют эти комплексы меченой люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека. Применяя меченые иммунные сыворотки против lgM- или lgG-антител, можно дифференцировать тип антител и обнаруживать ранний иммунный ответ по наличию lgM-антител.
Иммунофлюоресценцию широко используют не только в бактериологии, вирусологии, паразитологии, но и в иммунопатологии для обнаружения антител к тканевым антигенам человека.
Иммуноферментные или энзим-иммунологические методы основаны на использовании антител, конъюгированных с ферментами, главным образом пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Чтобы обнаружить соединение меченых антител с антигеном, добавляют субстрат, разлагаемый присоединенным к lgG ферментом, с окрашиванием в желто-коричневый (пероксидаза) или желто-зеленый (фосфатаза) цвет. Используют также ферменты, разлагающие не только хромогенный, но и люмогенный субстрат. В этом случае при положительной реакции появляется свечение. Подобно иммунофлюоресценции, иммуноферментный метод применяют для обнаружения антигенов в клетках или титрования антител на антигенсодержащих клетках.
Наиболее популярной разновидностью иммуноферментного метода является иммуносорбция. На твердом носителе, которым могут быть целлюлоза, полиакриламид, декстран и различные пластмассы, сорбируют антиген. Чаще носителем служит поверхность лунок микропанелей. В лунки с сорбированным антигеном вносят исследуемую сыворотку крови, затем меченую ферментом антисыворотку и субстрат. Положительные результаты учитывают по изменению цвета жидкой среды. Для обнаружения антигенов, на носитель сорбируют антитела, затем вносят в лунки исследуемый материал и проявляют реакцию меченой ферментом антимикробной сывороткой. Повышению чувствительности иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов способствует введение в систему реакции авидина и биотина.
Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Является наиболее чувствительным методом определения антигенов и антител, используется для определения гормонов, лекарственных веществ и антибиотиков, для диагностики бактериальных, вирусных, риккетсиозных, протозойных заболеваний, исследования белков крови, тканевых антигенов. Первоначально он был разработан как специфический метод измерения уровня циркулирующих в крови гормонов. Тест-системой являлись меченый радионуклидом гормон (антиген) и антисыворотка к нему. Если к такой антисыворотке добавить материал, содержащий искомый гормон, то он свяжет часть антител, при последующем внесении меченого титрованного гормона с антителами свяжется уменьшенное по сравнению с контролем его количество. Результат оценивают по сопоставлению кривых связанной и несвязанной радиоактивной метки. Эта разновидность метода носит название конкурентной реакции. Существуют и другие модификации радиоиммунологического метода.
Иммуногистологические методы предназначены для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например для обнаружения маркеров лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов пользуются или иммунофлюоресценцией, или иммуноферментными конъюгатами с пероксидазой. Количество специфических антигенов определяют по интенсивности окрашивания. Иногда используют автоматическую регистрацию с помощью спектрофотометра.
Иммуноблоттинг применяют для выявления антител к отдельным антигенам или «узнавания» антигенов по известным сывороткам. Метод состоит из 3 этапов:
- разделения биологических макромолекул (например, вируса) на отдельные белки с помощью электрофореза в полиакриламидном геле;
- переноса разделенных белков из геля на твердую подложку (блот), путем наложения пластины полиакриламидного геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозу (электроблоттинг);
- выявления на подложке искомых белков с помощью прямой или непрямой иммуноферментной реакции.
Как диагностический метод, иммуноблоттинг используют при ВИЧ-инфекции. Диагностическую ценность имеет обнаружение антител к одному из белков внешней оболочки вируса.
Источник
