Исследование хронической токсичности лекарственных средств
Нами разработана комбинация препарата «Противоспаечный гель» на основе аквакомплекса глицеросольвата титана и раствора минерала бишофит очищенного для профилактики образования послеоперационных спаек в брюшной полости, обладающий полифункциональным характером действия, доступностью и экономичностью сырья природного происхождения, что, в свою очередь, значительно снижает затраты на лечение данных заболеваний [1, 4, 10].
С момента формирования идеи о создании нового лекарственного препарата процесс его разработки неразрывно связан с проведением доклинических исследований. Такие исследования позволяют оценить эффективность того или иного вещества или их комбинации и выбрать наиболее оптимальный состав будущего лекарственного препарата. После утверждения его состава проводят доклинические исследования безопасности и эффективности [5, 8, 9].
Государственная регистрация лекарственного препарата осуществима лишь при условии детального изучения его специфической фармакологической активности и безопасности на этапе экспериментальных исследований. В России эти исследования проводятся в соответствии с приказом Министерства промышленности и торговли Российской Федерации от 14 июня 2013 г. № 916 « Об утверждении правил организации производства и контроля качества лекарственных средств».
Доклиническое исследование лекарственного средства включает в себя биологические, микробиологические, токсикологические и другие исследования лекарственного средства путем применения научных методов оценок в целях получения доказательств безопасности, качества и эффективности лекарственного средства [2].
Целью исследования является изучение хронической токсичности противоспаечного геля на этапе доклинического изучения.
Материалы и методы
Экспериментальное исследование проводилось в соответствии с общепринятыми правилами и правилами лабораторной практики GLP.
Содержание животных находилось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986; директива 86/609/EEC). Температура воздуха в виварии поддерживалась на уровне +20 — +24 о С. Влажность воздуха в виварии была не более 65 %, освещение — совмещенное [6].
Хроническую токсичность противоспаечного геля проводили на конвенциональных белых крысах 3,5-4 месячного возраста. Подопытных группам животных противоспаечный гель вводили интрагастрально в дозах: 0,2 г/кг (соответствует экспериментально — терапевтической дозе), 1,0 г/кг (соответствует промежуточной дозе, которая в 5 раз превышала терапевтическую) и 2,0 г/кг (соответствует токсической дозе, которая превышала терапевтическую в 10 раз). Контрольным животным интрагастрально вводили препарат тизоль (основа противоспаечного геля) в дозе 2 г/кг, курсом 1 месяц.
Взвешивание животных проводили на электронных весах МW — 120 (Корея) каждые десять дней от начала эксперимента. Вес крыс выражали в г.
Результаты исследований подвергали статистической обработке в программе Microsoft Excel и Statistica 6.0. с использованием t-критерия Стьюдента. Из элементов описательной статистики вычислялись: среднее арифметическое значение (М), стандартная ошибка среднего (m), стандартное отклонение.
Дизайн исследования
Влияние противоспаечного геля при курсовом введении крысам в течение 1-го месяца оценивали по общему состоянию, прибавки массы тела, пищевой, питьевой и поведенческой активностей, периферической крови, функциональным, биохимическим и патоморфологическим исследованиям.
По ходу эксперимента проводили наблюдения за общим состоянием животных, их поведением и потреблением корма и воды. Общее состояние животных оценивали по поведению, состоянию шерстного покрова, кожных и слизистых покровов, динамике массы тела.
Для исследования поведенческой активности животных в тесте «открытое поле» животное помещали в центральный квадрат установки, наблюдения вели в течение 3 мин. Учитывали: количество пересеченных квадратов — горизонтальная активность (ГДА); вертикальных стоек — вертикальная активность (ВДА); заглядываний в напольные отверстия — исследовательская активность (ИА); актов груминга (Гр.); актов дефекаций — по числу болюсов (ЭА).
Запись электрокардиограммы проводили через 1 месяц введения препарата, и через 1 месяц его отмены во втором стандартном отведении на тепловом трехканальном электрокардиографе ЭК3Т — 02 «АКСИОН» (Удмуртия, Ижевск). Для проведения биохимических исследований забранную кровь центрифугировали на центрифуге при 3000 об/мин и микропипеткой отделяли плазму. В плазме крови животных определяли содержание глюкозы, общего белка, трансаминаз, мочевины, креатинина.
О функции почек судили по содержанию мочевины и креатинина в плазме крови животных, а также функциональной пробе с феноловым красным. О функциональной активности печени судили в исследованиях нагрузочного теста с красителем бромсульфалеин (Хазанов А.М., 1968; Сандоре В.Ю. и соавт., 1976; Израйлет Л.И. и соавт., 1976).
Результаты исследований подвергали статистической обработке в программе Microsoft Excel, достоверность результатов оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования
По результатам наблюдений за состоянием животных, получавших противоспаечный гель в дозах 0,2; 1,0; и 2,0 г/кг (соответственно подопытные группы 1; 2 и 3) в течение одного месяца, особых изменений относительно 1-ой группы контрольных крыс, получавших тизоль в дозе 2 г/кг, не обнаружено. Все подопытные группы крыс были практически одинаковы в отношении состояния шерстного покрова, слизистых, потреблению пищи и воды, поведения. При этом у подопытных животных во 2-й и 3-й группах отмечались элементы седации, тенденции снижения подвижности и реакций на внешние раздражители.
В период введения вещества динамика изменений была положительной у всех животных, включенных в эксперимент. При этом достоверных различий в динамике прироста массы тела контрольных животных у всех подопытных групп не выявлялось. Отмечались лишь незначимые тенденции меньшей динамики прибавки массы тела у крыс самцов во 2-й и 3-й подопытных группах, нивелирующиеся до контрольных значений в течение месяца после отмены введения им противоспаечного геля.
Результаты исследований поведенческой активности крыс в тесте «Открытое поле» видны гендерные различия в поведенческой активности крыс, получавших противоспаечный гель в течение 1 месяца.
Результаты изучения электрокардиограмм крыс особых различий в показателях электрофизиологической активности миокарда у крыс в подопытных группах и группе контроль — 1 не зарегистрировано ни в период месячного интрагастрального введения противоспаечного геля, ни в период отмены его введения.
Результаты биохимических исследований плазмы крови крыс отмечены как однонаправленные, так и гендерные различия.
Результаты изучения влияния противоспаечного геля на биохимические показатели плазмы крови крыс-самцов
Источник
Исследование хронической токсичности лекарственных средств
Профилактика и лечение сосудистых заболеваний головного мозга является в настоящее время важной и актуальной задачей во всем мире. Инсульт – это серьезная проблема общественного здравоохранения, поскольку ежегодно около 15 миллионов человек во всем мире переносят инсульт [1; 2]. В нашей стране инсульт поражает более 450 000 человек в год, заболеваемость и смертность от острых нарушений мозгового кровообращения находится на 2-м месте среди других заболеваний. Для того чтобы избежать высокой смертности и инвалидности, необходимо раннее выявление и адекватное лечение инсульта, а также обязательное проведение реабилитационных мероприятий, которые препятствуют возникновению рецидива. Одним из компонентов реабилитации является медикаментозная терапия с использованием церебропротекторных, ноотропных и стресс-протекторных препаратов. Одним из перспективных направлений создания новых препаратов, обладающих церебропротекторным действием, является разработка инновационных соединений на основе пептидных биорегуляторов.
Новое потенциальное лекарственное средство (ЛС) на основе пептидэргического нейро- и стресс-протектора Nα-ацетил-D-лизил-лизил-аргинил-аргинил-амид является кандидатным препаратом для лечения нарушений мозгового кровообращения. Проведенные ранее доклинические исследования специфической фармакологической активности потенциального ЛС показали его высокую нейропротекторную эффективность in vivo [3]. Было показано, что данное потенциальное ЛС обладает антиишемической, антигипоксической, ноотропной и актопротекторной активностями [4]. Выявлено, что Nα-ацетил-D-лизил-лизил-аргинил-аргинил-амид, являющий активным фармакологическим ингредиентом потенциального ЛС, оказывает интегральное нейропротекторное действие, нормализует уровень провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α, а также повышает содержание противовоспалительного интерлейкина-4 в головном мозге. Защитное действие пептида при церебральной ишемии характеризуется также нейротрофическим компонентом.
Целью данной работы являлись доклинические исследования острой и хронической токсичности потенциального ЛС «Лизаргам» на основе пептидэргического нейро- и стресс-протектора для лечения нарушений мозгового кровообращения.
Материалы и методы исследования
Исследуемое потенциальное ЛС «Лизаргам, спрей назальный дозированный 0,5% и 1,0%» (далее потенциальное ЛС «Лизаргам»), один флакон потенциального ЛС содержит активный фармацевтический ингредиент («D-лизаргам, ацетат») – 15 (0,5%) или 30 (1,0%) мг; физиологический раствор (ФР) — 3,0 мл; D-маннит — 30 мг. «D-лизаргам, ацетат» представляет собой синтетический тетрапептид последовательности Nα-ацетил-D-лизил-лизил-аргинил-аргинил-амид в виде ацетатной соли. Терапевтическая доза потенциального ЛС у человека составляет 20 мкг/кг. Эта доза рассчитывалась исходя из данных по изучению специфической активности потенциального ЛС на экспериментальных животных и коэффициента экстраполяции доз мышей и крыс на человека в соответствии с руководством Т.А. Гуськовой [9].
Доклинические исследования были выполнены на основе рекомендаций действующих методических документов 7. Животные поступили из питомника РАМН «Рапполово» Ленинградской области. Основные правила содержания и ухода соответствовали правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.). Объем работ и перечень процедур был одобрен биоэтической комиссией института. Исследования проводили на 3 видах животных: белых беспородных крысах обоего пола (масса 180-200 грамм, возраст 9–10 недель), белых беспородных мышах обоего пола (19–21 г, 9–10 недель) и на кроликах породы шиншилла обоего пола (2-2,5 кг, 2-3 месяца).
Острая токсичность потенциального ЛС была изучена на мышах, крысах и кроликах. Период наблюдения после введения возрастающих доз составил 14 дней, для достижения высоких доз потенциальное ЛС вводили многократно в течение 10 часов. Эксперименты были проведены при интраназальном (и/н) и внутривенном (в/в) введении потенциального ЛС по одинаковым схемам. Мыши и крысы были случайным образом разделены на группы (по 5 самок и 5 самцов). В опытных группах мышам и крысам и/н вводили потенциальное ЛС в дозах 2, 20, 50 мг/кг; в/в — в дозах 20, 200, 500 мг/кг. И/н потенциальное ЛС вводилось животным при помощи автоматической одноканальной пипетки 10-100 мкл с соответствующим наконечником, введение осуществлялось в каждый носовой ход. В/в введение производилось в соответствии с требованиями [6], в максимальной дозе 500 мг/кг (50 мл/кг) каждой крысе вводили не более 2 мл за раз с интервалом 2 часа в течение 10 часов. Кролики были случайным образом разделены на группы (по 3 самки и по 3 самца в каждой). Кроликам в опытной группе потенциальное ЛС вводили и/н в дозе 25 мг/кг, в/в — в дозе 400 мг/кг. В контрольных группах животным по тем же схемам вводили ФР.
Во всех экспериментах проводили наблюдение за лабораторными животными в течение 14 суток после введения потенциального ЛС. Проводили клинический осмотр (ежедневно) до начала эксперимента (фоновые значения), а также выполняли взвешивание на 2, 7 и 14-й день после введения. У крыс и кроликов измеряли частоту сердечных сокращений (ЧСС) и частоту дыхательных движений (ЧДД). На 14-е сутки все животные были подвергнуты эвтаназии и патоморфологическому исследованию.
Оценка местнораздражающего действия была проведена на 3 кроликах-самцах. На слизистую оболочку правого глаза наносили 0,1 мл 1% потенциального ЛС, на слизистую оболочку левого глаза — 0,1 мл ФР. Наблюдение проводили в течение 24 часов с момента нанесения потенциального ЛС.
Испытания на пирогенность были проведены на кроликах-самцах и соответствовали требованиям ГФ XIII, ОФС 1.2.4.0005.15 [8]. Потенциальное ЛС вводили в ушную вену в объеме 0,2 мл/кг. Температуру измеряли 2 раза до начала исследования и каждые 30 минут в течение 3 часов после введения потенциального ЛС.
Хроническая токсичность потенциального ЛС была изучена на крысах, случайным образом разделенных на 4 группы (по 15 самок и 15 самцов в каждой). Потенциальное ЛС вводили и/н ежедневно, в течение 90 дней в 3 дозах: 1 мг/кг (50-кратная терапевтическая доза для человека, минимально возможная для экспериментального введения крысам), 3 и 5 мг/кг. Хроническая токсичность потенциального ЛС была также изучена на кроликах, самцах и самках, которые были случайным образом разделены на группы (по 3 самки и 3 самца в каждой). Потенциальное ЛС вводили и/н ежедневно, в течение 90 дней в 3 дозах: терапевтической дозе для кролика — 0,06 мг/кг (доза рассчитана путем умножения терапевтической дозы для человека на коэффициент пересчета по площади поверхности тела кролика 3,2); 3 мг/кг и максимальной — 5 мг/кг (более чем в 250 раз превышающей терапевтическую дозу для человека). Крысам и кроликам в контрольных группах по той же схеме вводили ФР.
Клинический осмотр животных выполняли ежедневно, в течение эксперимента регистрировали интегральные показатели состояния организма всех животных, а также патоморфологическое и патогистологическое исследования по окончании эксперимента. Физиологические исследования проводили до начала исследования, а также на 30-й и на 90-й день после начала введения потенциального ЛС.
Офтальмологическое исследование проводили на тех же сроках, оценивая состояние слизистых оболочек, наличие правильных роговичных рефлексов и измеряя величину зрачка и ширину глазной щели. Для лабораторных исследований собирали образцы крови и костный мозг.
Клинический анализ крови выполняли на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus Junior vet5 (Diatron, Венгрия) и на мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Биохимические показатели в сыворотках крови (аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотранфераза (АсАТ), билирубин, глюкоза, креатинин, мочевина, общий белок, холестерин, щелочная фосфатаза) оценивали на полуавтоматическом биохимическом анализаторе Chem-7 (Erba, Чехия). Исследование мочи выполняли на экспресс-анализаторе мочи DocUReader (ANALYTICON Biotechnologies AG, Германия). Кроме того, проводили микроскопический анализ миелограммы на мазках смывов костного мозга и подсчет количества клеток костного мозга. Все тесты выполнялись по стандартным протоколам и инструкциям производителей наборов.
На основании результатов эксперимента по изучению хронической токсичности рассчитывали расчетный безопасный курс (РБК) и индекс безопасности (ИБ) потенциального ЛС при клиническом применении в соответствии с инструкцией Т.А. Гуськовой [9].
Патоморфологическое исследование после завершения экспериментов включало в себя некропсию, макроскопическое исследование и взвешивание внутренних органов. Также рассчитывали отношение массы органа к массе тела.
Патогистологическое исследование было выполнено с использованием образцов тканей, полученных от животных, которым вводили потенциальное ЛС в максимальной дозе, а также образцов тканей от животных контрольных групп. Материал фиксировали в 10%-ном формалине, обезвоживали, заключали в парафин и изготовляли гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином («Биовитрум», Россия). Препараты изучали в световом микроскопе DMLB (Leica Microsystems AG, Германия).
Статистический анализ проводили с помощью программы Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation). Подсчитывали средние значения и ошибки среднего (М±m). Сравнение показателей между группами проводили с помощью непарного Т-критерия Стьюдента с неравными отклонениями, а также по U-критерию Манна-Уитни. Отличия считали достоверными при р 5) потенциальное ЛС «Лизаргам, спрей назальный» относится к III классу малотоксичных лекарственных препаратов.
- Изучение хронической токсичности на кроликах
Ежедневный клинический осмотр кроликов всех экспериментальных групп не выявил каких-либо значимых различий между группами, гибели подопытных животных не наблюдалось. Измерение массы тела показало, что данный параметр равномерно увеличивался на протяжении всего срока исследования как в контрольной, так и во всех опытных группах. Анализ показателей массы тела, потребления корма и воды, а также физиологических параметров (ЧДД, ЭКГ и ЧСС и АД) показал, что достоверные различия между всеми экспериментальными группами отсутствуют. Офтальмологическое исследование не выявило различий между экспериментальными группами, получавшими потенциальное ЛС или ФР.
Представленные в таблице 6 данные подтверждают, что ежедневное и/н введение потенциального ЛС в дозах 0,06-5 мг/кг в течение 30 и 90 дней не оказывало значительного влияния на количественный и качественный состав периферической крови кроликов. Также не было выявлено влияния потенциального ЛС на состояние красного костного мозга, биохимический состав крови, мочи и функциональную активность почек.
Оценка влияния ежедневного интраназального введения потенциального лекарственного средства «Лизаргам» на показатели периферической крови кроликов-самцов
Источник
