Ингибиторы матричных биосинтезов
Существует большая группа веществ, ингибирующих синтез ДНК, РНК или белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолевых заболеваний, а другие являются для человека сильнейшими токсинами. К последним можно отнести токсин бледной поганки α-аманитин, который является ингибитором эукариотических РНК-полимераз.
Действие ингибиторов матричных биосинтезов как лекарственных препаратов основано на:
· модификации матриц (ДНК или РНК);
· белоксинтезирующего аппарата (рибосом);
Центральное место среди них принадлежит антибиотикам – разнообразным по химическому строению органическим соединениям, синтезируемым микроорганизмами. Краткие сведения об антибиотиках, ингибирующих матричные синтезы, приведены в таблице 7.2.
Антибиотики – ингибируюшие матричные биосинтезы
Источник
Ингибиторы матричного биосинтеза лекарственные препараты
Существует большая группа веществ, ингибирующая синтез ДНК, РНК или белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолевых новообразований, а другие для человека оказались токсинами.
Действие ингибиторов матричных биосинтезов как лекарственных препаратов основано на модификации матриц: ДНК, РНК, белоксинтезирующего аппарата (прежде всего, рибосом) или на инактивации ферментов. Центральное место среди них принадлежит антибиотикам — разнообразным по химическому строению органическим соединениям, синтезируемым микроорганизмами, главным образом, микроскопическими грибами, и способным в малых количествах оказывать избирательное токсическое действие на другие микроорганизмы (табл. 4-5).
Таблица 4-5. Антибиотики — ингибиторы матричных биосинтезов как лекарственные препараты
Внедряются («интеркалируют») между парами оснований ДНК и нарушают репликацию и транскрипцию
Алкилирует ДНК и нарушает репликацию
Ингибируют ДНК-топоизомеразу II, ответственную за суперспирализацию ДНК, нарушают репликацию и транскрипцию
Связываются с бактериальной РНК-полимеразой и препятствуют началу транскрипции
Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность
Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию
Ингибирует инициацию трансляции. Связывается с 30S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК
А. Ингибиторы репликации — противоопухолевые препараты
Антибиотики, взаимодействующие с ДНК, нарушают её матричную функцию й вызывают подавление процессов репликации и транскрипции. Их используют для лечения злокачественных новообразований и называют противоопухолевыми препаратами (см. раздел 15). Дауномицин, доксорубицин и некоторые другие взаимодействуют с молекулой ДНК таким образом, что циклическая структура этих антибиотиков встраивается («интеркалирует») между парами оснований G = С, а углеводный компонент занимает малую бороздку ДНК (рис. 4-43). Это ведёт к локальному изменению структуры ДНК и ингибированию репликации и транскрипции.
Рис. 4-43. Строение «интеркаляторов» — дауномицина и актиномицина D.
К «интеркаляторам» относят также антибиотик актиномицин D, блокирующий синтез ДНК и РНК у про- и эукариотов. Это соединение слишком токсично, чтобы использовать его в клинических целях, но его широко используют в научно-исследовательской работе для изучения процессинга первичных транскриптов РНК.
Избирательность действия противоопухолевых антибиотиков невелика и обеспечивается более высокой по сравнению с нормальными клетками скоростью синтеза ДНК и РНК, а также повышенной проницаемостью клеточных мембран опухолевых клеток. В то же время эти соединения токсичны для быстроделящихся нормальных клеток организма, таких как стволовые клетки кроветворной системы, клетки слизистой оболочки желудка и кишечника, фолликулов волос. В последние годы проводятся исследования по созданию препаратов, обеспечивающих доставку ингибитора только в опухолевые клетки. Это достигается связыванием цитотоксических антибиотиков с белками, рецепторы к которым имеются главным образом на опухолевых клетках (см. раздел 15).
К препаратам, останавливающим репликацию, относят алкилирующие агенты и ингибиторы ДНК- топоизомеразы II (одной из изоформ топоизомераз). Последние называют ингибиторами гираз, поскольку ДНК-гиразы — ферменты прокариотических клеток, ответственные за суперспирализацию ДНК; у эукариотов аналогичную функцию выполняют ДНК-топоизомеразы. Известно, что транскрипция некоторых генов возможна лишь при определённом уровне суперспирализации матрицы. Соединения, вмешивающиеся в работу ДНК-гираз, могут ингибировать или активировать синтез РНК. К ингибиторам гираз принадлежат налидиксовая кислота, новобиоцин и номермицин.
Б. Ингибиторы транскрипции и трансляции — антибактериальные препараты
К ингибиторам матричных синтезов, оказывающим противобактериальное действие, относят вещества, блокирующие синтез РНК или белка. В эту группу входит широко применяемый в клинике рифампицин, получаемый на основе природного антибиотика рифамицина. Антибиотики из семейства рифамицинов ингибируют только бактериальную ДНК-зависимую РНК-полимеразу, связываясь с β-субъединицей фермента и препятствуя инициации транскрипции (рис. 4-44). Их применяют для лечения туберкулёза, так как эти препараты не влияют на работу ядерных РНК-полимераз эукариотических клеток. Однако они могут ингибировать синтез митохондриальных РНК, хотя дозы препарата, при которых блокируется образование митохондриальных РНК, выше тех, что используют в лечении инфекционного заболевания.
Рис. 4-44. Антибиотики из семейства рифамицинов.
Большая группа антибиотиков является ингибиторами трансляции (рис. 4-45): тетрациклины, эритромицин, пуромицин, хлорамфеникол и аминогликозиды. Так, один из наиболее известных аминогликозидов стрептомицин ингибирует инициацию синтеза белка у прокариотов и вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК. Его часто назначают при лечении инфекционных заболеваний сердца. К антибиотикам широкого спектра действия относят тетрациклины. Они связываются с 30Sсубъединицей рибосомы и блокируют присоединение аминоацил-тРНК в А-центр рибосомы, тем самым нарушая элонгацию полипептидной цепи. Тетрациклины эффективны в отношении возбудителей многих болезней. Левомицетин (хлорамфеникол) также относят к антибиотикам широкого спектра действия. Он ингибирует синтез белка за счёт присоединения к 50S субъединице рибосомы, подавляя пептидилтрансферазную активность.
Рис. 4-45. Некоторые антибиотики-ингибиторы синтеза белков у прокариотов.
Пенициллины и цефалоспорины относят к группе β-лактамных антибиотиков, продуцируемых плесенью штамма PeniciUum. В структуре этих молекул присутствует реакционноспособное β- лактамное кольцо, вызывающее ингибирование синтеза клеточных стенок у грамотрицательных микроорганизмов. Действие этих антибиотиков направлено на фермент, обеспечивающий образование поперечных связей в структуре белков клеточной стенки бактерий. Необратимое ингибирование активности этого фермента ведёт к образованию изменённых клеточных стенок и гибели бактерий в процессе размножения.
Надо сказать, что препараты антибактериальной группы отличаются высокой избирательностью и сравнительно мало токсичны для человека. Это объясняется различиями в структуре РНК-полимераз, РНК и белков рибосом в эукариотических и прокариотических клетках.
В. Вирусы и токсины — ингибиторы матричных синтезов в эукариотических клетках
Генетический материал вирусов представлен молекулой ДНК или РНК. Он, как правило, невелик и содержит информацию лишь о некоторых специфических белках и ферментах, необходимых для репродукции вируса (например, вирусов оспы, гриппа, полиомиелита, гепатита). Вскоре после заражения с высокой скоростью начинается синтез вирусных ДНК, РНК и белков с использованием ферментов и белков, субстратов и источников энергии клетки хозяина. При этом в инфицированных клетках прекращается синтез нуклеиновых кислот и белков, свойственных организму хозяина. Репродукция вирусных частиц идёт вплоть до гибели заражённой клетки.
Причиной гибели людей при отравлении бледной поганкой Amanita phalloides является токсин — α-аманитин, который содержится в теле гриба и вызывает необратимую дисфункцию печени и почек. Высокая токсичность этого соединения для человека связана с тем, что оно ингибирует эукариотические РНК-полимеразы. Наибольшую чувствительность к яду обнаруживает РНК-полимераза II, катализирующая синтез мРНК. Для α-аманитина LD50 (доза per os, при которой погибает 50% лиц, получивших токсин) составляет 0,1 мг/кг массы тела.
Чрезвычайно токсичен белок рицин, выделенный из клещевины обыкновенной. Он представляет собой N-гликозилазу, которая удаляет один остаток аденина из 28S рРНК большой субъединицы рибосомы и ингибирует синтез белка у эукариотов. Рицин — белковый компонент касторового масла, иногда используемого в качестве слабительного средства. Из-за высокой токсичности рицина лечение касторовым маслом проводят короткими курсами, так как длительное употребление может вызвать непрекращающийся понос, нарушение работы кишечника и даже гибель больного.
У человека развитие некоторых бактериальных инфекций сопровождается ингибированием матричных синтезов. Наиболее изученный пример — ингибирование синтеза белков в клетках слизистой оболочки зева и гортани энтеротоксином возбудителя дифтерии Corynebacterium diphteriae. Некоторые штаммы этого патогенного микроорганизма получают ген токсина от бактериального вируса, называемого β-фагом, который инфицирует бактерию и индуцирует синтез токсина — одноцепочечного белка с молекулярной массой 60 кД. В цитоплазме клеток хозяина под влиянием протеолитических ферментов токсин расщепляется на 2 фрагмента, один из которых является ферментом АДФ-рибозилтрансферазой. Этот фермент катализирует АДФ-рибозилирование и инактивацию фактора элонгации EF-2 по реакции:
В условиях in vitro эта реакция обратима, но при pH и концентрации никотинамида, которые существуют в клетках, она становится необратимой. Модификация фактора EF-2 нарушает транслокацию рибосом, ведёт к прекращению биосинтеза белков в инфицированных клетках и к их гибели. С действием токсина связаны основные симптомы дифтерии.
Описаны и другие токсины бактериального и растительного происхождения, ингибирующие синтез и функциональную активность белков путём АДФ-рибозилирования или модификации рРНК.
Интерфероны — небольшие белки (гликопротеины), состоящие примерно из 160 аминокислотных остатков. Они секретируются некоторыми клетками позвоночных в ответ на заражение вирусами и препятствуют распространению вирусной инфекции. Этот класс белков синтезируется в исключительно малых количествах: от нанограммов (10 -9 г) до пикограммов (10 -12 г), но является очень активным неспецифическим противовирусным агентом (10 6 — 10 9 единиц антивирусной активности на 1 мг белка). Это соответствует способности одной молекулы интерферона защищать от инфекции одну клетку.
Некоторые компоненты вирусных частиц (например, двухцепочечная РНК) индуцируют синтез по крайней мере 3 типов интерферонов. У человека имеются 14 генов, кодирующих α-интерфероны, которые продуцируются В-лимфоцитами и макрофагами, 5 генов β-интерферонов, обеспечивающих образование соответствующих белков фибробластами, и 1 ген y-интерферона, экспрессия которого идёт в Т-лимфоцитах.
Связываясь с рецепторами на плазматической мембране заражённых клеток, эти белки, подобно белковым гормонам, стимулируют синтез ферментов, способных разрушать мРНК вирусов и прекращать синтез белков на рибосомах, препятствуя тем самым экспрессии вирусных генов в клетках эукариотов.
Исследование механизма действия интерферонов показало, что они:
• ингибируют синтез белков, необходимых для репликации вирусов;
• стимулируют синтез фермента олигонуклеотидполимеразы, катализирующего образование небольших количеств коротких олигоаденилатов: 2′,5′-олиго (А). Эти олигонуклеотиды являются активаторами рибонуклеазы — фермента, расщепляющего матричные и рибосомные РНК;
• стимулируют синтез протеинкиназы, которая фосфорилирует и, тем самым, инактивирует фактор инициации eIF2:
eIF2 + АТФ —> eIF2 — ОРО3Н2 + АДФ.
В результате синтез всех белков в инфицированных клетках прекращается. Клетки погибают, но вместе с ними останавливается размножение вирусов, и начинается выздоровление. Таким образом, жертвуя небольшим количеством клеток, организм защищает себя от болезни.
В настоящее время интерфероны, полученные промышленным путём с использованием техники клонирования генов, широко используют при лечении обычной простуды, гриппа, полиомиелита, ветряной оспы, герпеса, вируса гепатита и других инфекций. Хорошие результаты показывает использование интерферонов в терапии некоторых видов злокачественных опухолей, главным образом, гемобластозов (см. раздел 15), хотя их роль в химиотерапии опухолей до настоящего времени остаётся малопонятной.
Биологическая библиотека — материалы для студентов, учителей, учеников и их родителей.
Наш сайт не претендует на авторство размещенных материалов. Мы только конвертируем в удобный формат материалы, которые находятся в открытом доступе и присланные нашими посетителями.
Если вы являетесь обладателем авторского права на любой размещенный у нас материал и намерены удалить его или получить ссылки на место коммерческого размещения материалов, обратитесь для согласования к администратору сайта.
Разрешается копировать материалы с обязательной гипертекстовой ссылкой на сайт, будьте благодарными мы затратили много усилий чтобы привести информацию в удобный вид.
© 2018-2021 Все права на дизайн сайта принадлежат С.Є.А.
Источник
Ингибиторы матричных биосинтезов
Существует большая группа веществ, ингибирующих синтез ДНК, РНК или белков. Некоторые из них нашли применение в медицине для лечения инфекционных болезней и опухолевых заболеваний, а другие являются для человека сильнейшими токсинами. К последним можно отнести токсин бледной поганки α-аманитин, который является ингибитором эукариотических РНК-полимераз.
Действие ингибиторов матричных биосинтезов как лекарственных препаратов основано на:
модификации матриц (ДНК или РНК);
белоксинтезирующего аппарата (рибосом);
Центральное место среди них принадлежит антибиотикам – разнообразным по химическому строению органическим соединениям, синтезируемым микроорганизмами. Краткие сведения об антибиотиках, ингибирующих матричные синтезы, приведены в таблице 7.2.
Антибиотики – ингибируюшие матричные биосинтезы
Ингибиторы репликации и транскрипции
Встраиваются между парами оснований ДНК, блокируют синтез ДНК и РНК у про- и эукариот
Ингибируют ДНК-топоизомеразу, ответственную за суперспирализацию ДНК
Связываются с бактериальной РНК-полимеразой
Ингибируют элонгацию: связываются с 30S субъединицей рибосомы и блокируют присоединение аа-тРНК в А-центр
Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует пептидилтрансферазную активность
Присоединяется к 50S субъединице рибосомы и ингибирует транслокацию
Ингибирует инициацию трансляции.Связывается с 50S субъединицей рибосомы, вызывает ошибки в прочтении информации, закодированной в мРНК
Использование днк-технологий в медицине
Достижения в области молекулярной биологии существенно повлияли на современную медицину: они не только углубили знания о причинах многих болезней, но и способствовали разработке новых подходов в их диагностике и лечению.
Для выявления дефектов в структуре ДНК она должна быть выделена из биологического материала и “скопирована” (наработана) в количествах, достаточных для исследования. Для генно-терапевтических работ необходимо выделение нормальных генов и введение их в дефектные клетки таким образом, чтобы они экспрессировались, позволяя восстановить здоровье пациента.
Выделение ДНК включает быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью центрифугирования, разрушение белков протеазами, экстрагирование ДНК с последующим её осаждением. В ходе выделения получают очень большие молекулы, их дополнительно фрагментируют с помощью рестриктаз. Образующиеся фрагменты разделяют методом электрофореза. Количество и длина получающихся фрагментов, и соответственно, расположение полос на электрофореграмме уникально и специфично для каждого человека.
Идентификация характерных последовательностей проводится методом блот-гибридизации по Саузерну. Фрагменты ДНК подвергают денатурации и осуществляют перенос (блоттинг) на плотный носитель (фильтр или мембрану). Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с небольшими фрагментами ДНК или РНК, содержащими радиоактивную (флюоресцентную или др.) метку. Такие фрагменты называют ДНК- или РНК-зондами. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Метод применяется для диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов.
Секвенирование (определение первичной структуры) ДНК проводится химическим или энзиматическим методом. Метод Маскама и Гилберта (химический) основан на химической деградации ДНК. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью радиоактивной или флюоресцентной метки. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят их идентификацию. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание – его положение. Так набор полос определяет нуклеотидную последовательность ДНК.
Метод Сэнгера (ферментативный) основан на моделировании ДНК-полимеразной реакции, где исследуемая молекула ДНК используется в качестве матрицы. В реакционную смесь добавляют дидезоксинуклеотиды (ОН-группа в 3′-положении пентозы отсутствует). ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированный нуклеотид не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате элонгация данной цепи останавливается в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид. Реакция проводится одновременно в четырех отдельных пробирках, каждая из которых содержит один из четырех дидезоксинуклеотидов и все 4 дезоксинуклеотидтрифосфата (к ним, как правило присоединяют радиоактивную или флюоресцентную метку). В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотида, проводят идентификацию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК.
Получение рекомбинантных ДНК и их амплификация. При получении рекомбинантных ДНК выделяют эти молекулы из двух разных источников. Каждую из них в отдельности фрагментируют, используя одну и ту же рестриктазу. После процедуры нагревания и медленного охлаждения смеси полученных фрагментов, наряду с исходными молекулами ДНК образуются и рекомбинантные, состоящие из участков ДНК, первоначально принадлежавших разным образцам. Используя технику рекомбинантных ДНК, удаётся исследовать варианты генов, ответственных за развитие многих заболеваний. Этим способом могут быть идентифицированы различные мутации.
Для получения значительных количеств рекомбинантного генетического материала проводят клонирование ДНК, предполагающее встраивание нужного фрагмента ДНК в векторную молекулу, Вектор обеспечивает проникновение этой рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий введенного фрагмента ДНК, а также синтез не свойственных бактериальной клетке, но весьма ценных для человека белковых продуктов. Таким способом получают вакцины, инсулин, гормон роста, факторы свертывания крови и др.
Работа с нуклеотидными последовательностями требует наличия достаточного количества материала для исследования. Поэтому фрагменты ДНК предварительно амплифицируют (увеличивают количество). Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предложенный в 1983 г. Карри Муллисом, позволяет подвергать специфической амплификации в условиях in vitro любые образцы ДНК.
Полимеразная цепная реакция протекает в три стадии:
Инкубационную смесь, в которой содержится образец нужной ДНК, нагревают до температуры 90°С. При этом в течение 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы образуется две одноцепочечные.
Источник
