Хроматография лекарственного растительного сырья

Хроматография лекарственного растительного сырья

К настоящему моменту в медицинской практике используется большое количество биологически активных веществ, относящихся к группе вторичных метаболитов растений [2]. Одними из наиболее популярных являются растительные полифенолы. Совместно с аскорбиновой кислотой полифенолы способны укреплять стенки кровеносных сосудов, стимулировать процессы кроветворения и регенерации, нормализовать окислительные процессы в организме. В связи с этим, становится актуальным вопрос быстрой и качественной оценки содержания соединений групп биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье. В данном случае, наиболее оптимальным решением представляется использование метода тонкослойной хроматографии.

Тонкослойная хроматография – это один из наиболее простых и известных вариантов жидкостной хроматографии, в котором разделение компонентов подвижной фазы происходит на открытом слое сорбента. К преимуществам данного метода относятся быстрота и легкость выполнения, а также низкие затраты. Однако, разработка и подбор оптимальной методики для исследований могут представлять значительную сложность [3].

Так как флора Оренбургской области характеризуется широким разнообразием видов лекарственных растений, то её можно рассматривать как дополнительный источник биологически активных веществ [4].

В связи с этим, цели нашего исследования:

1. Анализ компонентного состава экстрактов из шести видов растений, применяемых в народной и официальной медицине, методом тонкослойной хроматографии.

2. Выявление оптимальных условий для хроматографирования.

В качестве объектов исследования были взяты экстракты лекарственного растительного сырья следующих растений:

Боярышник кроваво-красный (Crataegus sanguinea), морковь посевная (Daucus carota), кровохлёбка лекарственная (Sanguisorba officinalis), шалфей лекарственный (Salvia officinalis), малина обыкновенная (Rubus idaeus), подорожник большой (Plantago major), марьянник луговой (Melampyrum pratense), вероника длиннолистная (Veronica longifolia).

Экстракты готовились с использованием 70 % этилового спирта по стандартной методике Государственной Фармакопеи XIII издания (фармакопейная статья «Экстракты») [1].

В качестве систем растворителей использовались смеси бутанола, уксусной кислоты и воды в разных соотношениях (4:1:5 и 4:1:3). Пробы 6 экстрактов наносились капиллярами в виде точек на две пластинки чешской фирмы «Silufol» длиной 13 см и 15 см, а также на пластинку российской фирмы «Sorbfil» длиной 10 см.

Хроматограммы были обработаны парами 25 % аммиака, расшифровка велась в УФ-свете. Для обнаружения флуоресцирующих веществ использовали источник света с максимумами излучения в области 254 и 365 мкм. Также применялась обработка хромогенными реактивами по методике ВИЛАР.

Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2. С помощью метода тонкослойной хроматографии выявлено, что наибольшим разнообразием групп биологически активных веществ отличаются экстракты кровохлебки лекарственной, боярышника кроваво-красного и шалфея лекарственного, а наименьшее разнообразие состава наблюдается в экстрактах сырья малины обыкновенной, марьянника лугового, подорожника большого и вероники длиннолистной.

Результаты хроматографического исследования на пластинках «Sorbfil»

Источник

Хроматография в анализе лекарственного растительного сырья, содержащего алкалоиды

Классификация видов хроматографии. Характеристики удерживания, используемые для идентификации химических веществ. Определение коэффициентов ёмкости колонки. Изучение природных соединений на примере алкалоидов. Выбор сорбента и систем растворителей.

Рубрика	Химия
Вид	курсовая работа
Язык	русский
Дата добавления	21.04.2014
Размер файла	5,3 M

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://allbest.ru

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

УО «Витебский государственный медицинский университет»

Кафедра фармакогнозии с курсом ФПК и ПК

Хроматография в анализе лекарственного растительного сырья, содержащего алкалоиды

студентка 3 курса 8 группы

1. Основные понятия в хроматографии

1.1 Хроматографические характеристики, используемые для идентификации веществ (характеристики удерживания)

1.2 Хроматографические характеристики, используемые для количественного определения веществ

2. Хроматография как метод исследования объектов окружающей среды

3. Классификация видов хроматографии

4. Преимущества использования хроматографических методов в изучении природных соединений

5. Практическое применение хроматографических методов в изучении природных соединений на примере алкалоидов

5.1 Тонкослойная хроматография

5.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Список используемых источников

Современная медицина располагает широким ассортиментом готовых лекарственных средств отечественного и зарубежного производства.

Одна из главных задач, направленных на развитие здравоохранения в нашей стране — улучшение качества выпускаемых химико-фармацевтической промышленностью лекарственных средств. В связи с этим все большее значение в контроле производства приобретают современные физико-химические методы. Во многих случаях целесообразно использование современных хроматографических методов, позволяющих совместить стадии разделения, идентификации и количественного определения. Возникновение хроматографии как научного метода связано с именем русского ученого М. С. Цвета, который в 1903 году осуществил разделение смеси растительных пигментов и заложил теоретические основы хроматографии. Значительным вкладом в развитие хроматографического анализа явились работы Н. A. Измайлова, М. С. Шрайбер, Е. Н. Гапона, Ю. М. Шемякина, К. В. Чмутова, A. Мартина, Р. Синджа и других ученых.

Цель работы: изучения литературных источников по теме «Хроматография в анализе лекарственного растительного сырья, содержащего алкалоиды».

Для достижения поставленной цели мною будут решены следующие задачи:

· раскрыть понятие «хроматография», изучить принципы ёё работы, дать полную классификацию хроматографических методов анализа, показать основные достоинства использования хроматографии;

· рассмотреть примеры практического применения хроматографии в анализе лекарственного растительного сырья на примере алкалоидов;

· дать характеристику алкалоидам как группе физиологически активных соединений.

1. Основные понятия в хроматографии

Хроматография — метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе, состоящей из несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз.

Хроматография — гибридный метод анализа, включающий разделение веществ и их последующее определение при помощи специальных устройств — детекторов.

В качестве неподвижной фазы в хроматографическом процессе выступает твёрдое вещество (сорбент) или плёнка жидкости, нанесённая на твёрдый носитель, а в качестве подвижной фазы — жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

В отличие от статических методов разделения — сорбции и экстракции хроматография является динамическим процессом.

При перемещении через неподвижную фазу подвижная фаза встречает на своём пути всё новые и новые слои сорбента, что сопровождается многократными повторениями актов сорбции и десорбции разделяемых веществ. Хроматографическое разделение обладает большей эффективностью по сравнению со статическими методами.

Расположение разделяемых веществ в виде отдельных зон вдоль колонки называют внутренней хроматограммой, а графическое изображение состава элюата (подвижной фазы, содержащей разделённые вещества), выходящего из колонки, получаемое, например, с помощью самописца — внешней хроматограммой.

Часть хроматограммы, соответствующая выходу из колонки элюента вместе с компонентом разделяемой смеси, называется пиком. [1]

1.1 Хроматографические характеристики, используемые для идентификации веществ (характеристики удерживания)

Время от момента ввода пробы до момента регистрации максимума пика называется временем удерживания (tR):

tR = tm + ts, tm — mobile (1)

Время удерживания вещества зависит от упаковки сорбента и поэтому может изменяться при переходе от одной колонки к другой.

Более надёжной характеристикой является исправленное время удерживания (tR’), которое равно разности между временем удерживания данного вещества и несорбируемого компонента (t0).

t0 = tm, то tR’=ts (2)

Объём подвижной фазы, который необходимо пропустить через колонку с определённой скоростью для того, чтобы элюировать вещество, называется удерживаемым объёмом (VR).

Аналогично понятию исправленное время удерживания существует понятие исправленный удерживаемый объём (VR’).

где F — объёмная скорость подвижной фазы (см 3 /мин).

Отношение равновесной концентрации вещества в неподвижной фазе (Cs) к его равновесной концентрации в подвижной фазе (Сm) называется коэффициентом распределения (D):

Удерживаемый объём связан с коэффициентом распределения уравнением, называемым основным уравнением хроматографии:

VR= Vm + DVs (либо VR’=DVs) (6)

Произведение коэффициента распределения на соотношение объёмов неподвижной и подвижной фазы называется коэффициентом ёмкости колонки (k’):

Фактор удерживания (подвижности Rf ), используемый в плоскостной хроматографии, представляет собой отношение расстояния от точки нанесения пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения пробы:

где b — расстояние, пройденное веществом, a — расстояние, пройденное фронтом растворителя. [2]

1.2 Хроматографические характеристики, используемые для количественного определения веществ

В качестве аналитического сигнала в хроматографии используют высоту или площадь хроматографического пика, которые пропорциональны содержанию вещества в хроматографической зоне.

где часть основания пика, заключённая между точками пересечения касательных, проведённых к точкам перегиба на сторонах пика , с нулевой линией ;

расстояние от вершины пика до его основания, измеренное параллельно оси ординат;

ширина пика на половине высоты. [1]

2. Хроматография как метод исследования объектов окружающей среды

Хроматография относится к современным методам химического анализа . Значение этого метода очень велико.

Хромотография позволяет изучать круговорот веществ в природе, идентифицировать загрязнения в атмосфере и природных водных бассейнах, широко используется в исследовании и производстве лекарственных средств, а также в изучении метаболизма веществ в организме человека.

Развитие хроматографии связано с разработкой все новых и новых методик, отражающих новые достижения в этой области аналитической химии. [3]

Без хроматографического метода сейчас не обходится химическая, фармацевтическая, текстильная, цветная металлургия и другие отрасли промышленности. Хроматографический метод положен в основу многих химико-технологических процессов производства.

На его принципе основан ряд простых переносимых приборов для определения состава природных газов при разведке нефти и газовых месторождений, а также для установления степени продуктивности нефтяных и газовых пластов. Хроматография интенсивно используется для анализа различных ископаемых в полевых условиях, почвенно-мелиоративных исследованиях. [4]

Метод ТСХ благодаря бесспорным преимуществам перед другими видами хроматографии (быстрота, простота, экономичность) находит все большее применение в науке и промышленности. Большой вклад дал метод ТСХ при изучении природных соединений животного и растительного происхождения.

Этот метод незаменим при анализе фармацевтических препаратов, исследовании промежуточных и конечных продуктов синтеза, определении устойчивости лекарств. Широко применяется этот метод в пищевой промышленности как для определения микроэлементов (Co, Ni, Cu, Zn), так и при идентификации липидов и жиров, а также стабильности витаминов и т.д. [3,4]В сельском хозяйстве и в биологической химии он применяется для разделения аминокислот, сахаров, нуклеиновых кислот, стероидов. Этот метод позволяет быстро и точно анализировать пестициды, особенно в сельскохозяйственных культурах, а также состав растений, почв и удобрений.

В настоящее время хроматографический метод анализа широко применяется при анализе воды и воздуха. ТСХ в сочетании с другими методами была использована для анализа магнитной фракции космической пыли.

Методом ТСХ удается быстро и четко разделить и идентифицировать очень малые количества смесей неорганических веществ (от десятых, а иногда и сотых долей микрограмма до нескольких десятков мкг). Разделению методом ТСХ подвергались представители практически всех групп элементов — щелочных, щелочноземельных, переходных, непереходных, лантаноидов и актиноидов. [4]

3. Классификация видов хроматографии

Существует более 50 различных хроматографических методов и вариантов. В основу их классификации могут быть положены:

1) агрегатное состояние подвижной и неподвижной фазы.

По агрегатному состоянию подвижной фазы — газовая, жидкостная;

По агрегатному состоянию неподвижной фазы — газотвёрдофазная, газожидкостная, жидкость-жидкостная, жидкость-твёрдофазная, жидкость-гелевая ( в названии хроматографического метода первым указывается агрегатное состояние подвижной фазы, а вторым — неподвижной ).

2) геометрическая форма неподвижной фазы.

Колоночная — хроматографический процесс проходит в пределах протяжённого цилиндрического пространства;

Капиллярная — диаметр проходного сечения пространства соизмерим с диаметром частиц неподвижной фазы, которая нанесена на стенки капилляра в виде тонкой плёнки;

Плоскостная — хроматографический процесс проходит в тонком слое.

3) преобладающий механизм разделения.

Адсорбционная — различная адсорбируемость разделяемых веществ неподвижной фазой;

Адсорбционно-комплексообразовательная — образование (в подвижной фазе или на поверхности неподвижной фазы) различных по устойчивости комплексных соединений;

Аффинная — различная способность разделяемых веществ к биоспецифическим взаимодействиям;

Ионообменная — различная способность разделяемых веществ к ионному обмену;

Осадочная — образование осадков, различающихся по растворимости;

Распределительная — различная растворимость разделяемых веществ

в неподвижной фазе или в подвижной и неподвижной фазах;

Эксклюзионная — различия в размерах и форме молекул разделяемых веществ.

4) цель проведения.

Информационная — получение информации о составе объекта (аналитическая хроматография) либо о его физико-химических свойствах (физико-химическая хроматография);

Технологическая — целью является само разделение. Применяется для выделения целевого компонента из смеси либо для его очистки.

5) способ получения хроматограммы.

Элюентная (проявительная). Сорбент, находящийся в хроматографической колонке, вначале промывают подвижной фазой (элюентом), обладающей меньшим сродством к неподвижной фазе, чем любое из разделяемыхвеществ. Затем в колонку вводят исследуемую смесь веществ и продолжают непрерывно пропускать элюент. Самый эффективный и в настоящее время практически единственный способ получения хроматограммы в количественном анализе.

Рисунок 1. Хроматограмма элюентной хроматографии.

Вытеснительная. Вначале в колонку вводят некоторое количество разделяемых веществ, которые распределяются в ней в порядке их сродства к неподвижной фазе. Затем в поток подвижной фазы вводят вещество-вытеснитель, которое имеет большее сродство к неподвижной фазе, чем любой из компонентов разделяемой смеси. Фронт вытеснителя движется по колонке, вытесняя ранее сорбированные вещества, которые, в свою очередь, вытесняют друг друга. Используется, в основном, для разделения макроколичеств веществ в препаративных целях.

Рисунок 2. Хроматограмма вытеснительной хроматографии

Фронтальная. В колонку непрерывно вводят раствор разделяемых веществ. Из колонки вначале будет выходить чистый растворитель, затем растворитель вместе с компонентом смеси, наименее прочно

удерживаемым неподвижной фазой, затем смесь растворителя, наименее прочно удерживаемого компонента и следующего по удерживанию компонента и т.д. Метод использовался на ранних стадиях развития хроматографии. [1]

Рисунок 3. Хроматограмма фронтальной хроматографии

4. Преимущества использования хроматографических методов в изучении природных соединений

Преимущество хроматографического метода перед другими физико-химическими методами анализа состоит в том, что в ряде случаев он применим тогда, когда другие методы разделения смеси оказываются непригодными. Метод дает возможность разделить малые количества веществ с очень близкими химическими свойствами. Хроматографический метод прост в выполнении и поэтому находит широкое применение для разделения самых разнообразных смесей неорганических и органических веществ.

Преимущество хроматографического метода перед химическим в том, что он дает не только количественную, но и качественную информацию и позволяет, в случае необходимости, определить любой компонент смеси газов, образующейся при разложении неорганического продукта.

Ещё один преимуществом является то, что этот метод при сравнительной простоте даёт большую производительность и может быть использован в непрерывных технологических процессах.

В настоящее время четко определилось еще одно преимущество хроматографического метода. Если вновь открываемые вещества присутствуют в исследуемом объекте в количествах, не позволяющих применять общеупотребительные аналитические приемы, то с помощью хроматографии возможно описать эти вещества, пользуясь их специфическими хроматографическими свойствами. К числу этих свойств относятся прежде всего: относительная скорость движения хроматографической полосы или зоны данного вещества на колонке адсорбента, а также положение, занимаемое исследуемым веществом в определенном месте адсорбционного ряда, установленного Цветом. [6]

5. Практическое применение хроматографических методов в изучении природных соединений на примере алкалоидов.

Среди физиологически активных соединений растительного происхождения алкалоиды занимают особое место. Первые алкалоиды были выделены из растений еще в XIХ веке.

В настоящее время налажен химический синтез некоторых из них, хотя, по-прежнему значительное большинство алкалоидов получают из растительного сырья. Алкалоиды — группа природных азотсодержащих соединений разнообразных по химическому строению.

Свое название эти вещества получили от арабского слова «алкали» (щелочь) и греческого «ейдос» (подобный).

Первый алкалоид был выделен из опийного мака (морфин). Затем из различных растений были выделены такие высокоактивные алкалоиды, как стрихнин, бруцин, кофеин, никотин, хинин, атропин и др., которые до сих пор широко используются в медицинской практике в качестве основных фармацевтических лечебных препаратов .

Выделение и унификация алкалоидов в начале XX века имели для практической медицины чрезвычайно большое значение. Лекарственные препараты, содержащие алкалоиды, фактически занимают одно из самых значительных мест в системе управления физиологическими процессами, протекающими в организме здорового и больного человека, и играют ведущую роль в лечении различных недугов. Биологическое действие алкалоидов настолько разнообразно, что нет необходимости перечислять их детально .

Интерес к алкалоидам среди исследователей велик и не подвержен влиянию моды. Для практического использования алкалоидов важно не только установить их наличие в растениях, но и получить очищенный препарат. В этом плане возможны различные подходы, однако такие препараты обязательно должны анализироваться по качественному составу и биологической активности. [7]

5.1 Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой метод разделения, в котором используется неподвижная фаза, состоящая из подходящего материала, нанесенного в виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из стекла, металла или пластмассы.

Перед хроматографированием растворы анализируемых веществ наносят на пластинку. Разделение основано на процессах адсорбции, распределения, ионного обмена или на их комбинации и осуществляется посредством перемещения в тонком слое (неподвижной фазе) исследуемых веществ, растворенных в растворителе или соответствующей смеси растворителей (подвижной фазе) [2]

Процесс подобен бумажной хроматографии, но его преимуществом является большая скорость анализа, более высокое качество разделения, и возможность выбора одной из неподвижных фаз, обладающей наиболее подходящими свойствами. В настоящий момент тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из основных методов анализа смесей органических веществ в научных лабораториях и полностью вытеснил бумажную хроматографию. [8]

Сорбенты. Как и для других органических соединений, для алкалоидов чаще всего используют силикагель. Ввиду слабого кислотного характера силикагеля алкалоиды адсорбируются на нем довольно прочно, поэтому следует пользоваться либо подщелоченным силикагелем, либо — что оказывается удобнее — вводить в систему растворителей компонент основного характера. Подщелачивание силикагеля чаще всего осуществляют 0,5 н КОН; иногда, однако, достаточно подвергнуть его действию паров аммиака. Некоторые слабоосновные алкалоиды можно разделять и на обычном силикагеле в более полярных проявляющих системах растворителей. Удобным также является окись алюминия.

Для разделения некоторых групп алкалоидов получает все большее распространение распределительная хроматография, обычно на слоях целлюлозы, пропитанной формамидом.

Этот способ имеет значительное преимущество главным образом при разделении структурно близких веществ, которые оказывается невозможно делить с помощью адсорбционной хроматографии. Изредка применяется в качестве сорбента крахмал.

Системы растворителей. Для хроматографирования алкалоидов на тонких слоях силикагеля большей частью пользуются системами с добавлением компонента основного характера, чаще всего органического основания, например диэтиламина или пиридина, а также системами, в которые входит аммиак. Обычной составной частью систем, применяемых на силикагеле, служит хлороформ, как правильно в смеси с низшими спиртами, например метанолом, этанолом или изопропанолом. Для слоев окиси алюминия помимо хлороформа часто пользуются бензолом, также в смеси с низшим алифатическим спиртом. [3]

ХЛОРОФОРМ-МЕТИЛОВЙ СПИРТ-УКСУСНАЯ КИСЛОТА (18:1:1);

БЕНЗОЛ-МЕТИЛОВЫЙ СПИРТ (19:1);

ХЛОРОФОРМ — ЭТИЛОВЫЙ СПИРТ и др. [4]

Принимая во внимание высокую чувствительность и разделяющую способность метода ТСХ, указанный метода был использовандля идентификации теобромина и кофеина при их совместном присутствии.

Это обусловлено тем, что существующие методики обнаружения пуриновых алкалоидов на дают объективной информации и довольно трудоемки, а использование ТСХ основано на применении систем растворителей, содержащих высокотоксические вещества ( бензол, хлороформ, метанол и др.). Указанные выше недостатки явились одной из главной причин изучения возможности применения нетоксических систем растворителей для решения поставленной задачи.

Исходи из физико-химических свойств изучаемых веществ, выбор сорбента и систем растворителей основывался на возможности использования специфического взаимодействия между сорбентом и определяемыми веществами, а также между последними и растворителями, с целью их разделения. В качестве сорбента использовали силикагель, а разделение производили на пластинках Силуфол УФ 254, размером 6,5*15 см.

Методика. На стартовую линию хроматографической пластинки в виде точки наносят 0,01-0,02 мл 0,1% раствора изучаемых веществ — теобромина и кофеина. Пластинку с нанесенными пробами высушивают в сушильном шкафу при 100 о С в течении 3-5 минут, затем помещают в камеру, предварительно насыщенную парами растворителей и хроматографируют восходящим методом. Длина пробега 10 см. После хроматографирования пластинку вынимают и высушивают при 100 о С до полного удаления растворителей. Последующее детектирование осуществляют путем помещения пластинки в камеру, насыщенную парами йода. При этом в зонах обнаружения веществ на хроматограмме появляются желтые пятна круглой или овальной формы. Результаты исследования приведены в таблице 1 и 2.

Таблица 1. Результаты хроматографического исследования теобромина.

Источник