Химико токсикологический анализ лекарственных средств

`Х =0,04 `Х =0,0473
S = 0,003
RSD (%) =6,4
Δ`Х = ± 0,006
Р =0,99
(`Х ± Δ`Х) = 0,041 – 0,053

Источник

Глава 7. Методы обнаружения ядовитых веществ в извлечениях из объектов

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Обнаружение ядовитых, сильнодействующих и наркотических веществ после их изолирования из биологических объектов является следующим этапом химико­токсикологического исследования.

Несмотря на большое число реакций и методов качественного анализа, используе­мых в аналитической и фармацевтической химии, требуются некоторые особые подходы для их использования в токсикологической химии. Это объясняется особенностями объ­ектов исследования, возможными примесями и требованиями к достоверности резуль­татов.

Химик-токсиколог для обнаружения в объекте какой-либо группы веществ или опре­деленного вещества обязан использовать только те реакции и методы, которые апробиро­ваны на биологических объектах, рекомендованы для целей химико-токсикологического анализа с учетом всех факторов, влияющих на получаемые результаты. Только в этом случае полученные данные могут быть объективными и застрахованными от возможных ошибок, среди которых могут быть ошибки, связанные с получением ложноположитель­ных или ложноотрицательных результатов.

Ложноположительный результат – это заключение о наличии токсических, экзоген­ных веществ при анализе по определенной методике при фактическом их отсутствии. Это свидетельствует об использовании высокочувствительной, недостаточно специфич­ной методики и возможном отсутствии ее апробации на биологических объектах, осо­бенно находящихся в стадии гнилостного разложения.

Если какое-либо вещество или его метаболит присутствуют в объекте в концентрации ниже предела их обнаружения, то возможно получение ложноотрицательных результа­тов. Причиной этого чаще всего выступает фактор времени, т.е. интервал времени между контактом ядовитого вещества с организмом человека или животного и временем взятия и направления объекта на анализ. В этом случае даже правильно выбранная методика с высокой чувствительностью может дать отрицательный результат.

Для обнаружения токсических соединений в биологических объектах в настоящее время применяются различные химические реакции, физические, физико-химические, биологические (фармакологические) и другие методы. Среди них выделяют методы и ре­акции предварительного анализа и методы и реакции подтверждающего исследования.

Использование предварительного анализа или предварительных химических реакций преследует цель обнаружить или исключить из анализа группу веществ или какое-либо индивидуальное вещество. Таким реакциям или методам придают «судебно-химическое значение при отрицательном результате». Это означает, что если при использовании данного метода или реакции вещество или группа веществ не обнаружены, дальнейший анализ на эти соединения не проводят и в заключении указывают, что данное вещество или группа веществ в исследуемом объекте не найдены.

Предварительные реакции и методы должны быть чувствительными, но необяза­тельно специфичными. Среди них – скрининговые методы (ТСХ, Г’ЖХ – скрининг, им- мунохимические методы) и реакции, которые оцениваются как имеющие значение при отрицательном результате: групповые реакции осаждения, хромогенные реакции и др. Эти способы и реакции должны быть обязательно подтверждены химическими и физико­химическими методами.

Предварительные реакции и методы, как правило, не позволяют определить инди­видуальные вещества. Это требует проведения дополнительных исследований. В ток­сикологической химии такие исследования называют подтверждающим анализом, под­тверждающими (частными) реакциями или частным внутригрупповым скринингом. Среди них методы ВЭЖХ, ГЖХ, ТСХ, УФ- и ИК-спектрометрия, спектрофотометрия в УФ области спектра, масс-спектрометрия, хроматомасс-спектрометрия, люминесцент­ный анализ, аналитические реакции разных типов (кислотно-основные, окислительно- восстановительные, комплексообразования), микрокристаллоскопический метод, фармакогностический анализ, фармакологические пробы, а также процессы осаждения, экс­тракции и др.

Подтверждающие методы по чувствительности обычно выше или равны предвари­тельным методам исследования. Это позволяет снизить возможность получения ложно­отрицательных результатов. По специфичности подтверждающие методы обычно пре­восходят предварительные, что снижает количество ложноположительных результатов.

При проведении химико-токсикологического анализа с использованием химического метода необходимо учитывать следующие обстоятельства.

Любое чужеродное вещество в организме частично или полностью подвергается ме­таболизму, и поэтому его можно не обнаружить известными реакциями.

В процессе изолирования ядовитые вещества извлекаются не полностью и могут быть частично потеряны, поэтому используемые реакции должны отличаться высокой чувствительно стью.

Объекты, присылаемые на анализ, могут находиться в состоянии гнилостного раз­ложения. Продукты разложения (птомаины) обычно извлекаются из объекта вместе с исследуемым веществом и могут искажать результаты анализа. Поэтому при анализе та­ких объектов использование химических реакций возможно после тщательной очистки извлечений.

При комбинированных отравлениях (например, этиловым спиртом и его суррогата­ми) применение характерных реакций затруднено присутствием близких по химическим свойствам соединений. В этих случаях предусмотрено строгое соблюдение условий вос­произведения реакций (окисления, температурного режима и т.д.), чтобы предотвратить обнаружение одних соединений (более ядовитых) вместо других. Например, при несо­блюдении условий проведения реакции окисления можно переоткрыть метиловый спирт за счет этилового спирта.

Каждая используемая химическая реакция должна быть рекомендована в опреде­ленной модификации применительно к исследуемому объекту. Это особенно важно в тех случаях, когда проводят исследование объекта на «металлические» яды, посколь­ку многие из них являются микроэлементами и могут быть обнаружены в извлечениях. В таблице 5 даны пределы содержания токсикологически важных элементов в печени и почках – объектах, которые рекомендуются для анализа при подозрении на отравление «металлическими» ядами и содержат наибольшее количество микроэлементов.

В связи с варьированием содержания элементов в тканях, для количественного опре­деления металлов в минерализате для каждого катиона предложены не менее двух мето­дов, которые позволяют определять их в широких пределах концентраций.

По схеме дробного метода анализа предусматривается разбавление минерализата до концентраций, когда естественно содержащийся микроэлемент не может быть обна­ружен, а концентрация попавшего в организм элемента останется достаточной для его обнаружения. При проведении реакций к минерализату добавляют определенный объем воды очищенной, а затем вносят соответствующие реактивы. Приведенные в таблице 6 разведения позволяют исключить обнаружение микроэлементов и одновременно снизить кислотность минерализата.

Таблица 5. Пределы содержажания некоторых элементов в тканях организма человека (по данным А.Н. Крыловой)

Границы естественного содержания, мг на 100 г органа

Таблица 6. Разбавление минерализата при анализе его на «металлические» яды

Объем минерализата,
мл

Объем воды
очищенной, мл

Граница обнаружения, мг/100 г

При анализе минерализата на «металлические» яды применяется избирательная экс­тракция в виде диэтилдитиокарбаматов с целью выделения меди, висмута, цинка и кад­мия в органическую фазу, свободную от мешающих ионов. Специфичность экстракци­онных методик выделения этих катионов достигнута за счет использования правила ряда диэтилдитиокарбаматов металлов:

Hg 2+ , Аg + , Cu 2+ , Ni 2+ , Со 2+ , Bi 3+ , Sb 3+ , Cd 2+ , Pb 2+ , Zn 2+ , Mn 2+

Согласно этому ряду каждый предыдущий металл вытесняет последующий из его соли с диэтилдитиокарбаминовой кислотой.

Таблица 7. Маскировка некоторых мешающих ионов в химических реакциях на исследуемые металлы

Со 2+ , Zn 2+ , Fe 3+ , Сd 2+ , Fe 2+ , Hg 2+ , Ag +

Ag + , Pb 2+ , Fe 2+ , Bi 2+ , Fe 3+ , Sb 3+ , Cd 2+ , Hg 2+

Bi 3+ , Fe 3+ , Sb 3+ , Cd 2+ , Hg 2+ , Ag + и др.

Селективная экстракция с дитизоном используется для обнаружения ионов свинца, серебра, таллия, цинка, которые при определенном значении pH среды образуют окра­шенные дитизонаты.

Для исключения влияния других ионов на результаты реакций при анализе минерали­зата используют прием маскировки мешающих ионов (табл. 7). С этой целью используют цианиды, фториды, фосфаты, тиосульфаты, тиомочевину, гидроксиламин, аскорбиновую кислоту, комплексон III (трилон Б) и др. Мешающие ионы образуют с этими веществами комплексные соединения и не влияют на результаты реакций, проводимых на исследуе­мые элементы.

Абсолютно специфичных реакций очень мало. По правилам проведения химико­токсикологического анализа для заключения об обнаружении в извлечении из объекта ядовитого соединения необходимо провести не менее 3-4 характерных для данного ве­щества реакций. Например, чтобы сделать вывод об обнаружении в дистилляте этилово­го спирта, необходимо, чтобы три реакции дали положительный результат: образование йодоформа, окисление спирта до уксусного альдегида и образование эфира с уксусной кислотой (этилацетата).

Результаты некоторых химических реакций оцениваются как «реакции Corpus delicti». Это реакции, продукты взаимодействия которых можно представить вместе с заключением об отравлении как неоспоримое доказательство обнаружения в объекте данного вещества. К числу таких реакций относятся: реакция образования берлинской лазури, результат об­наружения мышьяка в аппарате Марша, реакция образования «серебряного зеркала» и др. Полученный синий осадок берлинской лазури запаивают в небольшую пробирку или ам­пулу и представляют судебно-следственным органам для обоснованности заключения об обнаружении в объекте синильной кислоты. Восстановительная трубка аппарата Марша и микрофотографии налета на ней, имеющего характерную форму кристаллов в виде окта­эдров, убедительное доказательство обнаружения мышьяка в исследуемом объекте.

Для увеличения избирательности некоторых реакций и повышения их чувствитель­ности иногда рекомендуется предварительное выделение ядовитого вещества из иссле­дуемого раствора с использованием экстракции и реэкстракции. Например, чтобы отде­лить изоамиловый спирт от других «летучих» ядов и воды, его из дистиллята извлекают диэтиловым эфиром, эфир испаряют и в остатке обнаруживают изоамиловый спирт со­ответствующими реакциями. Фенол выделяют из дистиллята, подщелоченного гидрокар­бонатом натрия, также путем экстракции диэтиловым эфиром, что позволяет повысить избирательность и чувствительность реакций на него.

При химическом анализе на любое чужеродное соединение эксперт должен руковод­ствоваться специально изданными и утвержденными методиками и соответствующими методическими указаниями.

Комплексное использование различных методов предварительного и подтверж­дающего анализов позволяет надежно диагностировать причину отравления или бо­лезненного состояния организма.

Обнаружение ядовитых веществ и их метаболитов в процессе предварительного и подтверждающего химико-токсикологического анализа не дает однозначного отве­та о количестве яда, попавшего в организм, времени его приема, фазах распределения. Результаты количественного определения найденного токсического соединения позволя­ют выбрать способ детоксикации и лечения пострадавшего при остром и хроническом отравлении.

Выбор метода количественного определения ядовитого вещества в извлечении из объекта зависит:
– от предполагаемой концентрации токсического вещества по результатам предвари­тельного и основного (подтверждающего) исследования;
– от степени «свежести» объекта и наличия в извлечении продуктов разложения бел­ковых молекул;
– от времени, прошедшего от момента попадания яда в организм и до начала ана­лиза;
– от степени «чистоты» извлечения и наличия фона эндогенных соединений;
– от способности токсического вещества и его метаболитов накапливаться в опреде­ленных органах и тканях;
– от последствий отравления. В случае смертельного исхода чувствительность мето­дик должна быть 10 -3 – 10 -7 г/мл. При наркотическом опьянении, затяжном отравле­нии или после проведенных детоксикационных мероприятий – 10 -8 – 10 -13 г/мл.

7.1. Методы предварительного анализа

7.1.1. Понятие об аналитическом скрининге в химико­токсикологическом анализе

Многообразие лекарственных, наркотических, ядовитых веществ, которые могут быть причиной отравлений, требует проведения предварительного отсеивающего исследова­ния. В токсикологической химии такие исследования принято называть аналитическим скринингом. Скрининг (screening) в переводе с английского означает «просеивание», «отбор», «сортировка».

Аналитический скрининг – это система методических приемов, позволяющих в ходе исследовательских операций исключить («отсеять») или определить группы веществ (индивидуальные соединения) на этапе предварительного исследования.

Это позволяет построить дальнейший анализ в нужном направлении. Аналитический скрининг является эффективным при его соответствии определен­ным требованиям:
– специфичность (чаще групповая);
– высокая чувствительность;
– экспрессность;
– точность и воспроизводимость;
– возможность сочетания с другими методами анализа.

Скрининг используется при анализе многокомпонентных смесей, а в случае ненаправ­ленного анализа – при исследовании извлечения из биологического объекта на неизвест­ное токсическое вещество.

В настоящее время понятие скрининга в токсикологической химии значительно шире.

Скрининг – это поэтапное движение к выявлению индивидуального вещества путем последовательного исключения групп ядовитых веществ, а затем отсеивания веществ в обнаруженной группе до выявления конкретного соединения.

Из современных скрининговых методов в практике химико-токсикологического анализа нашла широкое применение хроматография в тонких слоях сорбента (ТСХ) в нормально-фазовом и обращенно-фазовом вариантах. Этот метод доступен, прост в вы­полнении, отличается высокой чувствительностью, эффективностью, экспрессностью и достаточной специфичностью (избирательностью).

ГЖХ-скрининг используется, в основном, при анализе летучих, лекарственных и нар­котических веществ.

Не потерял своего значения аналитический скрининг с использованием различных химических реакций.

Имеются разработки по использованию в качестве скрининговых методов высоко­эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), абсорбционной спектроскопии, им- мунохимических методов, спектроскопии ядерного магнитного резонанса.

При использовании этих методов необходима тщательная очистка извлечений от эн­догенных соединений, способных исказить результаты анализа и засорить колонки хро­матографов.

7.1.2. ТСХ-скрининг в нормально-фазовом варианте

Метод используется в химико-токсикологическом анализе при исследовании веществ, изолируемых из объекта экстракцией и сорбцией (лекарственные, наркотические веще­ства, пестициды).

Неподвижной фазой в ТСХ служит тонкий слой сорбента (0,1-0,5 мм), содержащий не­большое количество воды и нанесенный на пластинку (из стекла, фольги или полимера).

Сорбентом чаще всего является силикагель или оксид алюминия, которые закрепля­ются на пластинке добавлением связующего компонента – гипса, крахмала и др.

В качестве подвижной фазы (элюента, системы растворителей) предложены индиви­дуальные растворители или их смеси в определенных соотношениях. При движении элю­ента за счет капиллярных сил вверх по пластинке происходит разделение смеси веществ. Эффективность разделения зависит от сродства вещества к сорбенту и определяется ко­эффициентом распределения его между обеими фазами – подвижной и неподвижной.

Чтобы обнаружить вещество на пластинке, используют различные способы детек­тирования:
– визуальный, если само вещество окрашено;
– облучение пластинки УФ-лучами, при этом вещество может флуоресцировать или давать темные пятна;
– обработка пластинки соответствующими реагентами-проявителями, которые спо­собны образовать с веществом окрашенные соединения.

Для идентификации вещества используют величину Rf – отношение длины пробега ана­лизируемого вещества к длине пробега растворителя (рис. 8). После хроматографирова­ния измеряют расстояние от центра пятна до стартовой линии (отрезок АБ) и от линии фронта жидкости до стартовой точки (отрезок АВ). Отношение отрезков АБ к АВ обо­значают величиной Rf:

Величина Rf характерна для данного соединения на данном сорбенте в данной систе­ме растворителей. Она зависит от качества и активности сорбента, толщины слоя, при­роды растворителей и их соотношения, а поэтому не всегда воспроизводима.

Более надежной оценкой хроматографической подвижности вещества является вели­чина R,. Для ее определения находят величину Rf исследуемого вещества и Rf вещества, принятого за стандарт. Их отношение малочувствительно к влиянию случайных откло­нений в условиях эксперимента:

Rs = Rf вещества / Rf стандарта

Поэтому Rs — более воспроизводимая и относительно постоянная величина.

Общий ТСХ-скрининг в нормально-фазовом варианте был разработан на кафедре токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова для систематического судебно­химического анализа биологических объектов на лекарственные и наркотические ве­щества, включенные по Приказу М3 СССР №1021 в обязательный круг исследования эксперта в случае ненаправленного анализа. Этот метод применим для веществ кислот­ного, нейтрального, слабоосновного и основного характера. ТСХ-скрининг предполага­ет разделение веществ в общих системах растворителей на хроматографические зоны с последующим исследованием каждой зоны, в которой были обнаружены те или иные соединения с использованием частных систем растворителей.

Как мы уже отмечали ранее, лекарственные и наркотические вещества из биоло­гических объектов изолируются путем настаивания с подкисленным спиртом (методы Стаса-Отто, Саломатина), нейтральным ацетоном (метод Карташова), подкисленной во­дой (методы Васильевой, Степанова-Швайковой, Поповой, Крамаренко), подщелоченной водой (метод Валова). Из полученных извлечений (вытяжек) вещества кислотного, ней­трального и слабоосновного характера экстрагируются диэтиловым эфиром или хлоро­формом при рН=2-2,5, а вещества основного характера – при рН=8-10. Хлороформные (эфирные) экстракты упаривают до небольшого объема и исследуют.

Применительно к веществам, включенным в учебную программу по токсикологиче­ской химии, схему ТСХ-скрининга в общих системах растворителей можно представить следующим образом (по Б.Н.Изотову).

ТСХ-скрининг веществ кислотного, нейтрального и слабоосновного характера

Цель: выявить наличие токсикологически важных лекарственных веществ в извлечени­ях и определить их принадлежность к определенной группе соединений.

Условия анализа: сорбент – закрепленный слой силикагеля. Система растворителей: хлороформ ацетон (9:1). Время насыщения камеры парами системы – 15-20 мин. Длина пробега системы растворителей по пластинке 10 см. На стартовую линию хроматогра­фической пластинки наносят (см. рис. 9):
– полоса А – растворы стандартов (например, барбамила, антипирина);
– полоса Б – 1/25 часть эфирного экстракта, полученного из водного извлечения при рН=2;
– полоса В – стандарт (раствор циклобарбитала);
– полоса Г – 1/10 часть эфирного экстракта, полученного из водного извлечения при рН=2.

Реагенты-проявители для обнаружения веществ на пластинке:

– слой сорбента полос А, Б и В обрабатывают 5% раствором сульфата ртути (II) и 0,1% раствором дифенилкарбазона в хлороформе. Производные барбитуровой кислоты проявляются в виде фиолетовых пятен. Пластинку нагревают горячим фе­ном (

50°С). Пятна обесцвечиваются.
– затем эти же полосы на пластинке обрабатывают 10% раствором хлорида железа (III). При этом проявляются производные пиразола, салициловой и бензойной кислот;
– при последующей обработке этих полос модифицированным реактивом Драгендорфа и 10% раствором серной кислоты обнаруживаются вещества основ­ного характера, такие как кофеин, производные 1,4-бензодиазепина и др. Обработка пластинки раствором серной кислоты повышает чувствительность реактива Драгендорфа.

Все вещества кислотного, нейтрального и слабоосновного характера делятся на 3 хрома­тографические зоны в зависимости от значения величины Rf в указанной общей системе растворителей.

Зона 1 включает 2 вещества, имеющие значение Rf 0-0,25. В этой зоне обнаружива­ются антипирин (Rf 0,19) и кофеин (Rf 0,25).

Зона 2 включает 7 веществ, имеющих значение Rf 0,31-0,41. В этой зоне обнаружива­ются фенобарбитал (Rf 0,31), барбитал (Rf 0,32), нитразепам (Rf 0,35), барбамил (Rf 0,37), этаминал-натрий (Rf 0,37), бутобарбитал (Rf 0,41), циклобарбитал (Rf 0,41).

Зона 3 включает вещества, имеющие значение Rf 0,41-0,64. В этой зоне обнаружива­ется диазепам (Rf 0,62).

Полоса Г на пластинке используется для соскабливания сорбента (заштрихован­ная часть), элюирования веществ подходящим растворителем (1 зона – метанолом; 2 и 3 зоны – ацетоном) и последующего хроматографического исследования в частных системах растворителей, в которых все вещества обнаруженной группы соединений хо­рошо разделяются между собой.

ТСХ-скрининг в анализе веществ основного характера

Цель: выявить наличие в извлечении из объекта веществ, являющихся соединениями основного характера.

Условия анализа: сорбент – закрепленный слой силикагеля. Система растворителей: хлороформ – диоксан – ацетон – 25% раствор аммиака (45:47,5:5:2,5), время насыщения камеры парами системы – 15 мин. Пробег растворителя по пластинке – 10 см.

На стартовую линию хроматографической пластинки наносят (рис. 10):

– полоса А – растворы стандартов (например, атропина и новокаина);

– полоса Б – 1/25 часть хлороформного экстракта, полученного из водного извлече­ния при рН=8-10;
– полоса В – раствор стандарта этаперазина;
– полоса Г – 1/10 часть хлороформного экстракта, полученного из водного извлече­ния при рН=8-10.

Реагенты-проявители: слой сорбента полос А, Б, В (при закрытой полосе Г) последо­вательно обрабатывают:

– 10% раствором хлорида железа (III). Возможно обнаружение производных фено­тиазина и пиразола;

– 5% раствором нитрита натрия, содержащим 3% хлорной кислоты. Обнаруживают ярко выраженные окрашенные пятна производных фенотиазина;

– 10% раствором серной кислоты и просматривают в УФ-лучах. Возможно обнару­жение хинина по голубой флуоресценции;

– модифицированным реактивом Драгендорфа. Вещества основного характера про­являются в виде оранжевых пятен на бледно-желтом фоне.

Соединения основного характера делятся на пластинке на 4 хроматографические зоны, в зависимости от значения Rf.

Зона 1 включает 8 веществ со значением Rf 0,12-0,36. В этой зоне обнаруживаются пахикарпин (Rf 0,12), морфин (Rf 0,14), атропин (Rf 0,15), эфедрин (Rf 0,18), хинин (Rf 0,25), стрихнин (R 0,25), кодеин (Rf 0,28), этилморфин (Rf 0,31).

Зона 2 включает 3 вещества со значением Rf 0,5-0,58. В этой зоне обнаруживаются этаперазин (Rf 0,51), антипирин (Rf 0,54), кофеин (Rf 0,56).

Зона 3 включает 7 веществ со значением R, 0,63-0,83. В этой зоне обнаруживаются хлордиазепоксид (Rf 0,63), дипразин (Rf 0,66), новокаин (Rf 0,7), тиоридазин (Rf 0,72), аминазин (Rf 0,75), промедол (Rf0,76), нитразепам (R, 0,77).

Зона 4 включает 4 вещества со значением Rf 0,87-0,98. В этой зоне обнаруживаются левомепромазин (Rf 0,87), папаверин (Rf 0,91), диазепам (Rf 0,95), кокаин (Rf 0,98).

Полосу Г (заштрихованная часть) соскабливают, элюируют соответствующим раство­рителем, для хроматографической зоны 1 применяют метанол – диэтиламин (9:1), для 2, 3,4 хроматографических зон метанол – 25% раствор аммиака (9:1). Затем проводят ис­следование полученных элюатов в частных системах растворителей, в которых вещества данной зоны хорошо разделяются.

Если ни в одной из зон ни с одним из реактивов пятна на пластинках не обна­ружены, делают заключение о ненахождении в объекте исследуемых веществ. При обнаружении пятна в какой-либо из зон проводят основное исследование с использо­ванием подтверждающих реакций и методов.

При экспресс-анализе острых отравлений наркотическими и психотропными веще­ствами ТСХ-скрининг проводят на двух пластинках в двух системах растворителей:
1. толуол – ацетон – этанол – 25% раствор аммиака в соотношении компонентов 45:45:7,5:2,5;
2. диоксан – хлороформ – ацетон – 25% раствор аммиака в соотношении компонен­тов 47,5:45:5:2,5.

На обе пластинки «Силуфол УФ-254» наносят аликвоты извлечений из объекта и стандартные растворы морфина, кокаина, кодеина, аминазина, димедрола, амитрип- тилина и помещают в указанные системы растворителей. Когда системы растворителей достигают высоты 10 см, пластинки вынимают и, после высушивания, просматривают в УФ-свете. Отмечают пятна стандартных веществ и на том же уровне пятна, получен­ные из вытяжки (извлечения из объекта). Дополнительно на эти зоны наносят капельно реактивы на предполагаемые вещества.

Например:
– смесь серной кислоты и этанола (1:9) для производных фенотиазина;
– реактив Марки для опиатов;
– концентрированную серную кислоту для димедрола и т.д.

Хроматографирование в двух системах растворителей разной полярности позволяет до­статочно надежно провести групповое, а в ряде случаев индивидуальное обнаружение наркотических и психотропных веществ.

ТСХ-скрининг токсических веществ кислотного и основного характера по методу В.А.Карташова

Исследование проводят на специально приготовленных хроматографических пластин­ках по следующей методике. К 3 г силикагеля марки КСК добавляют 0,2 г гипса и 7,5 мл воды для веществ кислотного характера или 0,025 М раствора гидроксида калия для ве­ществ основного характера. Смесь перемешивают в ступке до однородной массы, нано­сят на обезжиренную стеклянную пластинку размером 9х 12 см, подсушивают и активи­руют при 120°С 30 мин.

Вещества кислотного характера

Сухой остаток, полученный при изолировании по методу В.А.Карташова и содержащий вещества кислотного характера, растворяют в небольшом объеме хлороформа и количе­ственно наносят на стартовую линию хроматографической пластинки (рис. 11). По кра­ям стартовой линии наносят хлороформные растворы «стандартов» (дифенин и тиопентал).

Условия анализа. Система растворителей: ацетон – н-гексан – диэтиламин (10:10:1). После высушивания пластинку обрабатывают раствором сульфата ртути. Вещества кис­лотного характера проявляются в виде полосы, а «стандарты» – в виде пятен белого цвета.

Таблица 8. Хроматографические группы веществ кислотного характера

Таблица 9. Распределение веществ по хроматографическим группам

1 группа 22 вещества

2 группа 16 веществ

3 группа 7 веществ

4 группа 18 веществ

5 группа 12 веществ

6 группа 5 веществ

Анабазин
Морфин
Атропин
Пахикарпин
Бруцин
Стрихнин
Кониин
Хинин и др.

Аминазин
Новокаинамид
Промедол
Димедрол
Тиоридазин
Дипразин
Кодеин
Этилморфин и др.

Дикаин Скополамин и др.

Феназон
Новокаин
Тизерцин
Кокаин
Элениум и др.

Папаверин
Феназепам
Мезапам
Нитразепам
Оксазепам и др.

Эфедрин Седуксен Резерпин и др.

По полученным данным вещество относят к одной из трех хроматографических групп (табл. 8).

Зону силикагеля, содержащую исследуемое вещество, соскабливают, элюируют хло­роформом, который далее исследуют с помощью частных реакций и физико-химических методов.

Вещества основного характера

К экстракту из щелочного раствора, полученного при изолировании по методу В.А.Карташова, добавляют 2 капли 10% спиртового раствора хлороводородной кислоты и выпаривают при 40°С досуха. Остаток растворяют в небольшом объеме хлороформа, насыщенного аммиаком, и наносят в виде полосы на стартовую линию хроматографи­ческой пластинки (рис. 12). Справа и слева в две точки на линию старта наносят смесь из 5 «стандартов»: кодеина, дикаина, новокаина, амидопирина и седуксена.

Условия анализа. Подвижная фаза – ацетон. После высушивания пластинку рас­сматривают в УФ-лучах (светофильтры 254 и 360 нм), отмечают флуоресцирующие зоны, затем обрабатывают реактивом Драгендорфа. «Стандарты» образуют на пластинке пятна оранжевого цвета, и пластинка делится на 6 зон. Исследуемое вещество, проявляющееся; на пластинке в виде окрашенной полосы, попадает в одну из шести хроматографических групп (см. табл. 9).

Если ни в одной из зон не обнаруживаются полосы оранжевого цвета, делают за­ключение, что в исследуемом объекте вещества основного характера отсутствуют. Если обнаружено пятно, окрашенную зону снимают с пластинки, добавляют гидроксид натрия и экстрагируют диэтиловым эфиром. Эфир испаряют и проводят основное исследование на вещества, относящиеся к определенной группе, используя частные химические реак­ции и различные физико-химические методы.

7.1.3. ТСХ-скрининг в варианте «Toxi-Lab АВ»

В этом варианте модифицирован классический метод тонкослойной хроматографии. Это специально разработанная аналитическая система, которая предназначена для исследо­вания одной пробы объекта (мочи) на наличие наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ. Эта система обеспечивает стадию пробоподготовки, экс­тракцию, концентрирование, разделение веществ и их обнаружение.

Эта система представлена тремя наборами экстракционных пробирок с органиче­ским растворителем определенного состава, набором ТСХ-пластин, концентрационных дисков и сосудами для обнаружения веществ:
– «Toxi-Lab А» используется для обнаружения веществ основного, нейтрального ха­рактера (опиаты, метадон, амфетамины и др.);
– «Toxi-Lab В» используется для обнаружения веществ кислотного и нейтрального характера (барбитураты, органические кислоты и др.);
– «Toxi-Lab Cannabinoid» используется для обнаружения тетрагидроканнабинола и его производных.

Методика использования системы включает несколько стадий:
– экстрагирование из мочи в специальных экстракционных пробирках экстрагентом определенного состава при рН=4,5 веществ кислотного и нейтрального характера (барбитураты и др.), при рН=9 веществ основного и нейтрального характера (опиа­ты, амфетамины, метадон и др.);
– концентрирование полученных экстрактов на сорбирующем материале, представ­ленном в системе в виде микродисков (диаметром 2,5 мм) под струей теплого воз­духа.
– хроматографирование с использованием специальных пластин, имеющих углубле­ния на линии старта, в которые вставляются диски с сорбированными веществами (рис. 13). Пластины изготовлены из микроволоконной стеклобумаги, пропитанной кремниевой кислотой и раствором соли ванадия («Toxi-Lab А») и без раствора соли ванадия. («Toxi-Lab В»). Системы растворителей для «Toxi-Lab А»: этилаце- тат – метанол – вода очищенная (29:10:5), для «Toxi-Lab В»: этилацетат – дихлорметан (40:60). К обеим системам добавляют 25% раствор аммиака в отношении 1:4 или 1:5 (зависит от условий лаборатории).
– обнаружение веществ на пластинах проводится путем последовательного погруже­ния их в сосуды, заполненные специальными хромогеннымисосгавами (реактив Марки-Манделина, модифицированный реактив Драгендорфа и др.); также об­лучение пластинок УФ-светом при 366 или 254 нм.

На рисунке 13 представлены пластины из каталога системы «Toxi-Lab А» для веществ основного и нейтрального характера. Пластины I, II и III детектированы с помощью реак­тивов Марки-Манделина. Сначала пластинки выдерживали в парах 37% формальдегида и затем погружали в концентрированную серную кислоту, содержащую 0,1% ванадата ммония. Пластина III промыта погружением в воду и освещена УФ-лучами при 254 нм, IV пластина обработана модифицированным реактивом Драгендорфа. На пластины в места 1, 2, 3, 4 фирмой-производителем нанесены растворы стандартных соединений лекарственных и наркотических веществ.

Идентификация веществ на пластинах проводится по окрашенным в определенные цвета или флуоресцирующим пятнам путем сравнения с характеристиками стандартных соединений, нанесенных на пластины производителем.

Метод ТСХ в варианте «Toxi-Lab» позволяет не использовать один из факторов пло­хой воспроизводимости результатов ТСХ-анализа – нанесение пробы на пластинку в ее классическом варианте. Многостадийное детектирование исключает возможность непра­вильной интерпретации получаемых результатов. Предел обнаружения веществ состав­ляет 1 мкг/мл (морфин). В наборе реактивов и оборудования в данной системе предусмо­трено наличие каталога с образцами результатов анализа более чем для 100 различных токсических веществ и их метаболитов.

7.1.4. ТСХ-скрининг в обращенно-фазовом варианте (ОФТСХ)

Метод разработан сотрудниками кафедры токсикологической химии Пермской госу­дарственной фармацевтической академии. Сорбентом является тонкий слой силикаге­ля «Сорбтон-2» с привитой алкильной фазой С2 и «Плазмохром» с привитой фазой С.. Привитые фазы придают сорбенту гидрофобные свойства. В качестве связующего ком­понента использована соль кремниевой кислоты, за счет которой слой оказался доста­точно прочным и позволил применять для детектирования последовательно несколько реагентов с целью обнаружения различных групп химических соединений. Для веществ кислотного, нейтрального и слабоосновного характера авторами предложена система растворителей этанол – вода (3:7), для веществ основного характера – этанол – вода – 25% раствор аммиака (6:5,5:0,5). Для обнаружения токсических веществ на хроматогра­фических пластинках в качестве реактивов рекомендуются:
– для веществ кислотного характера – растворы хлорида железа (III), растворы суль­фата ртути и дифенилкарбазона (в хлороформе);
– для веществ нейтрального характера – фурфурол, подкисленный йодплатинат;
– для веществ основного характера – раствор нингидрина, раствор серной кислота в этаноле, реактивы Драгендорфа, Марки, Манделина и др.

Предел обнаружения веществ на пластинках при обращенно-фазовом варианте в 2-3 раза меньше по сравнению с нормально-фазовым вариантом ТСХ. Идентифицируют веще­ства на пластинках по величине Rf или по величине R, при хроматографировании в при­сутствии вещества-«стандарта».

7.1.5. Внутригрупповой ТСХ-скрининг в частных системах растворителей

Любой вариант ТСХ может быть использован для определения индивидуальных веществ в извлечениях из биологического материала. Для этого необходимо использовать усло­вия, разработанные для узкого круга ядовитых веществ. В качестве «стандартов» берут вещества из этой же группы. Как пример приводим определение индивидуального бар­битурата, если на предварительном этапе выявлено наличие барбитуратов в извлечении (методика описана Б.Н.Изотовым).

На пластинку со слоем силикагеля, как показано на рисунке 14, наносят растворы стандартов: барбитала, фенобарбитала, барбамила, этаминала, бутобарбитала (по 2 капли 1 % растворов), а рядом – извлечение из объекта или часть элюата, полученного с пла­стинки (полоса Г на рис. 10).

Для обнаружения места расположения пятен используют специальные реактивы, ко­торыми опрыскивают с помощью пульверизатора пластинку после ее проявления в си­стеме растворителей и высушивания.

Система растворителей (частная для барбитуратов): хлороформ – н-бутанол – 25% раствор аммиака (70:40:5). Сорбент – силикагель КСК, забуференный 0,1 М раство­ром борной кислоты.

Для производных барбитуровой кислоты пластинку обрабатывают в начале раство­ром сульфата ртути (II), а затем раствором дифенилкарбазона в хлороформе.

Барбитураты проявляются в виде сине-фиолетовых или красно-фиолетовых пятен и имеют следующие значения Rf: барбитал – 0,55; фенобарбитал – 0,40; барбамил – 0,90; этаминал – 0,95; бутобарбитал — 0,65.

Пятно стандарта и пятно анализируемого вещества должны иметь одинаковую окраску и одинаковое значение Rf.

Можно привести такие же примеры по определению индивидуальных веществ из других трупп токсикологически важных веществ (морфинана, хинолина, фенилалки- ламина и др.).

7.1.6. Газожидкостная хроматография

Газожидкостная хроматография является одним из эффективных методов при прове­дении скрининга. Основным условием использования этого метода является летучесть соединений при температуре испарителя. Во многих методиках рекомендуется перево­дить исследуемые вещества в легколетучие соединения путем их дериватизации. В таких случаях метод ГЖХ является универсальным способом для проведения скрининга.

Газожидкостная хроматография – это один из видов распределительной хроматогра­фии. Разделение веществ происходит в специальных колонках, заполненных твердым носителем, представляющим собой пористый материал природного или синтетического происхождения (пемза, кизельгур, полисорб, целит и др.). Зернистый носитель набивает­ся в колонку – трубку малого диаметра длиной от нескольких сантиметров до нескольких метров. Колонки изготовляют из нержавеющей стали, меди, алюминия, стекла и других материалов. Твердый носитель имеет тонкий слой неподвижной фазы.

Неподвижная жидкая фаза может быть неполярной – апиезоны (L, М, N, SE-30, OV-1, OV-101). Это углеводороды и полимеры, в основном, диметил- и триметилсилана:

Неподвижная фаза может быть полярной и чаще всего представлена полиэтиленгли- колем с массой 20 ООО – карбовакс-20М, фенилметилсиланом OV-17, цианоэтилсиланом ХЕ-60 и др. Подвижной фазой является инертный газ, чаще всего азот или гелий. Принцип устройства газожидкостного хроматографа приведен на рисунке 15. Исследуемый объ­ект вносят в дозатор (3) в количестве нескольких микролитров с помощью микрошпри­ца. Вещества переносятся газом-носителем (7) в колонку (5). На колонке происходит разделение компонентов смеси. Разделение смеси зависит от величины коэффициентов распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами и от эффективности колонки. Эффективность колонки выражается числом теоретических тарелок. Под «те­оретическими тарелками» понимают количество теоретических ступеней, на которых устанавливается равновесие между подвижной и неподвижной фазами. Чем больше та­ких ступеней на единицу длины колонки, тем лучше происходит разделение веществ.

Из колонки разделенные вещества поступают в детектор (6). Детектор – часть при­бора, которая регистрирует интенсивность определенных свойств бинарных смесей (ком­понент + газ-носитель). Изменение интенсивности сигнала детектора свидетельствует об изменении состава газовой смеси. Детекторы могут быть настроены на измерение интенсивности различных физико-химических свойств системы (плотности, теплопро­водности, теплоты сгорания, ионизации и т.д.), которые преобразуются в электрический сигнал детектора, регистрируемый самописцем (7).

В практике химико-токсикологического анализа используют катарометр – детектор теплопроводности. Катарометром измеряют разность теплопроводностей чистого газа- носителя и смеси газа-носителя с анализируемым веществом. Чувствительность опреде­ления токсических веществ с помощью катарометра находится в пределах 10 -3 — 10 -5 г.

Пламенно-ионизационный детектор (ПИД). Принцип действия основан на измере­нии тока, возникающего при ионизации молекул органических веществ в пламени водо­рода. При горении чистого водорода ионы почти не образуются, поэтому электропровод­ность водородного пламени очень низка. Органические вещества, сгорающие в пламени водорода, образуют ионы или радикалы. Появление заряженных частиц обусловливает электропроводность пламени. Увеличение электропроводности повышает силу ионно­го тока, которая отображается на хроматограмме в виде пика. Чувствительность ПИД — 10 -9 – 10 -12 г. Хроматограмму двух растворенных веществ можно представить следующим образом (рис. 16).

На кривой разделения каждому пику свойственны следующие параметры. Высота пика (2) – это расстояние от вершины пика до его основания (3). Площадь пит (4) – пло­щадь, заключенная между контуром пика и его основанием. Основание пика (3) – отрезок нулевой линии (1) между крайними точками пика.

Качественной характеристикой в газожидкостной хроматографии считаются:
– Время удерживания вещества. Это время от момента введения смеси веществ в до­затор до момента вычерчивания максимума пика самописцем. При постоянных условиях анализа характерно для данного вещества.
– Относительное время удерживания. Это отношение времени удерживания иссле­дуемого вещества к времени удерживания стандарта.
– Объем удерживания. Эту величину получают путем умножения времени удержи­вания на объемную скорость газа-носителя. Это общий объем подвижной фазы, необходимый для удаления данного вещества из колонки.
– Относительный объем удерживания. Его определяют в присутствии стандартного вещества путем деления найденного времени удерживания компонентов на вре­мя удерживания стандартного вещества после вычитания времени удерживания инертного газа-носителя из обоих значений времени удерживания.
– Удельный удерживаемый объем. Это объем удерживания на 1 г неподвижной жид­кой фазы. Эта величина является константой, подобной точке кипения, и более на­дежна для идентификации.
– Индекс удерживания (I). Индекс удерживания предложен Ковачем в 1958 г. Он основан на логарифмической шкале, в которой нормальные парафины имеют значения индексов удерживания, в 100 раз превышающие число атомов угле­рода в их молекуле. Например, 200, 300, 400 для этана, пропана, н-бутана соот­ветственно. Поэтому величины 1/100 рассматривают как число атомов углерода в н-парафине, который определялся бы с интересующим нас веществом. Индекс удерживания – более воспроизводимая характеристика для вещества, чем относи­тельный объем удерживания. Он пропорционален логарифму удельного объема удерживания.

В основе идентификации веществ с помощью ГЖХ – сравнение индекса удерживания неизвестного вещества с индексом удерживания известного соединения.

7.1.6.1. ГЖХ-скрининг в анализе лекарственных и наркотических веществ в извлечениях из мочи

Исследуемые вещества выделяют из мочи путем экстракции или сорбции. Для ГЖХ- скршшнга достаточно использовать часть извлечения из объекта, которая соответствует по объему 10 мл мочи (представлено по методикам, описанным С.К.Ереминым).

Условия хроматографического анализа: прибор ЛMХ-80, детектор термоаэро­зольный (ТАД), термоионный или беспламенный азотно-фосфорный (NPD), колонка стеклянная, силанизированная, длиной 1 м, внутренний диаметр – 2-3 мм, сорбент – 3% SE-30 на хромосорбе W (HP) – 80-100 меш., скорость газа-носителя (азота) для ТАД 45 мл/мин и для NPD – 40 мл/мин (гелия), эффективность колонки 1200 т.т. (ТАД) и 1300 (NPD), температура детектора – 300°С, температура испарителя 250°С, темпера­тура испарителя по линейной программе от 130 до 290°С, объем пробы – 2,5 мкл.

Для идентификации хроматографических пиков определяют индекс удерживания (Ix). С этой целью используют в качестве стандартов смесь н-алканов СnН2n+2 с числом атомов углерода от 10 до 32, которым присвоены значения индексов, равные 100n (n – число атомов углерода в алкане). Расчет проводят по формуле:

Ix = 100n + (I_n+1 – I_n) · [(lg t_x – lg t_n) / (lg t_n+3 – lg t_n)]

Вместо исправленного времени удерживания иногда используют в расчетах истин­ные удерживаемые объемы.

При работе с другими детекторами вместо н-алканов используют в качестве стандар­тов смесь азотсодержащих веществ, индексы удерживания которых также предваритель­но определены по н-алканам при тех же условиях (см. табл. 10). Стандартное отклонение измеренных индексов удерживания находится в пределах 15-20 единиц. При скрининге «поисковое окно» должно находиться в пределах ±50-60 единиц I, если сравнивается I неизвестного соединения с I известных веществ.

Таблица 10. Смесь анализируемых веществ для расчета индексов удерживания

Вещество

Индекс удерживании по н-алканам

Источник

Вам также может понравиться

Скованность в шее. Симптомы, причины, народные средства и полезные советы

От скованности в шее можно легко избавиться.

Целебные свойства язвенника обыкновенного и народные средства от волдырей

Язвенник обыкновенный Язвенник обыкновенный – это двулетнее

Зубная боль. Лечение, последствия, народные средства

1. Лечение зубов Нет людей, которые не боятся стоматолога.

Ящики для хранения лекарственных препаратов

Контейнеры для лекарств Сбросить все фильтры ул.

Ящик для аптечки первой медицинской помощи

Аптечки первой помощи Правила поведения Современные

Ячмень чем лечить народная медицина

Бабушкины рецепты при лечении ячменя Избавиться от

Ячмень отек народные средства

Ячмень — симптомы и лечение Что такое ячмень?

Ячмень народные средства яйцо

Ячмень на глазу: причины, симптомы и лечение Веки выполняют