Готовая лекарственная форма глф это
Вирус папилломы человека (ВПЧ) 6 и 11 типов принадлежит к группе малого онкогенного риска и в 90 % случаев является причиной аногенитального кондиломатоза и рецидивирующего респираторного папилломатоза [8]. В настоящее время на фармацевтическом рынке отсутствуют лекарственные средства, специфически направленные на лечение данных заболеваний [11]. В связи с этим одним из перспективных направлений фармацевтической разработки являются терапевтические вакцины на основе онкобелка Е7 ВПЧ, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Постоянное присутствие в инфицированных клетках и исключительно вирусное происхождение раннего онкобелка Е7 делает этот антиген идеальной мишенью для высокоспецифичных способов иммунотерапии ВПЧ-ассоциированных заболеваний.
В ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» разработана терапевтическая вакцина против заболеваний, ассоциированных с ВПЧ 6 и 11 типов, в форме стерильной суспензии для инъекций [3]. Действие препарата направлено на индукцию специфических Т-клеточных иммунных ответов против ранних вирусных онкобелков, что позволит обеспечить подавление или эрадикацию существующего в организме инфекционного агента [9].
Стандартизация лекарственного препарата является неотъемлемым звеном процесса фармацевтической разработки, в ходе которой разработанная стратегия контроля качества должна обеспечивать выпуск безопасного и эффективного продукта. Критическим моментом контроля качества терапевтической вакцины является отсутствие международного стандартного образца, что требует разработки внутреннего стандарта предприятия [13].
Основными критериями для выбора методов контроля качества являются физико-химические свойства целевых белков, состав вспомогательных веществ, а также чувствительность предложенных методик. Требования к контролю качества готовой лекарственной формы (ГЛФ) в виде суспензии для инъекций отражены в отечественной и зарубежных фармакопеях [2, 7].
Целью настоящего исследования является разработка методов и критериев контроля качества терапевтической вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза для подготовки проекта фармакопейной статьи предприятия.
Материалы и методы исследования
Терапевтическая вакцина содержит в прививочной дозе (0,5 мл) по 100 мкг гибридных рекомбинантных белков, представляющих собой слитые аминокислотные последовательности онкобелков Е7 ВПЧ 6 и 11 типа и белка теплового шока HSP70 Mycobacterium tuberculosis, полученные в культуре Saccharomyces cerevisiae [3]. Белки сорбированы на алюминия гидроксиде. Готовая форма не содержит консервантов и антибиотиков. Режим хранения при температуре от 2 до 8 °С.
Для оценки подлинности использовали метод иммуноблоттинга с антителами, специфичными ко всем структурным единицам действующего вещества вакцины. Подлинность препарата оценивали по наличию на проявленных электрофореграммах основной полосы рекомбинантного белка, соответствующей по электрофоретической подвижности стандартному образцу предприятия. Для проявления электрофореграмм использовали коммерческие антитела, специфичные к антигену Е7 типа 6 (706-C5, HyTest, Финляндия), антигену Е7 типа 11 (711-66, HyTest, Финляндия) и белку теплового шока 70 Mycobacterium tuberculosis (TS29, HyTest, Финляндия). При пробоподготовке образцов для проведения электрофоретического разделения проводили десорбцию белков стандартным буферным раствором, содержащим 2 % натрия додецилсульфата и 100 мМ дитиотретола (ДТТ). Полученные образцы прогревали на водяной бане при 98–100 °С в течение 3 мин, охлаждали и центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Процедуру разделения белков проводили методом Леммли в восстанавливающих условиях в 8 % полиакриламидном геле (ПААГ) с использованием оборудования для вертикального электрофореза Mini-protein Tetra cell (Bio-Rad, США). По окончании разделения осуществляли полусухой перенос разделенных в ПААГ белков в системе Bio-Rad Transblot SD Semi-dry Transfer Cell (Bio-Rad, США). При иммуноспецифической идентификации использовали систему антител: первичные моноклональные антитела мыши к различным структурным элементам действующего вещества вакцины в концентрации 5 мкг/мл и затем поликлональные антитела козы против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с щелочной фосфатазой (Sigma, США) в разведении 1:5000. Относительную подвижность белковых полос и интенсивность окрашивания полос определяли с помощью системы для документирования гелей G-Box Chemix XR5 и программного обеспечения GeneTools (Syngene, США).
Определение содержания общего белка проводили методом Лоури с десорбцией [5]. Десорбцию 0,1 М раствором натрия гидроксида проводили в течение 30 мин при температуре 18–25 °С. Для определения общего белка использовали коммерческий набор Modified Lowry Protein Assay Kit (Thermo sciеntific, США).
Оценку полноты сорбции осуществляли путем измерения содержания белка в надосадочной жидкости сорбированного препарата методом Лоури [5].
Оценку параметров: описание, рН, механические включения, прозрачность и цветность раствора, микробиологический и токсикологический контроль проводили согласно требованиям ГФ XII изд. [1]. Параметры: извлекаемый объем, размер частиц суспензии, седиментационную устойчивость и полнотуа сорбции – оценивали согласно требованиям ГФ XI изд., вып. 2 [2].
Результаты исследования и их обсуждение
Оценка подлинности рекомбинантных белков включает методы определения молекулярной массы, электрофоретической подвижности, а также иммуноспецифических характеристик отдельных структурных единиц гибридных белков, сорбированных на алюминия гидроксиде [10]. При иммунопроявлении мембран антителами разной специфичности, независимо от типа антигена Е7, обнаруживалась основная полоса рекомбинантного белка, подвижность которой соответствовала электрофоретической подвижности основной полосы стандартного образца.
Для оценки пригодности используемой методики проведена валидация по показателям: предел обнаружения и надежность.
Проведенные исследования показали, что использованный метод пробоподготовки образцов позволяет сохранить антигенную структуру действующего вещества вакцины. На электрофореграммах экспериментальных и стандартных образцов независимо от специфичности используемых антител детектировалась одна основная полоса с молекулярным весом около 90 кДа. Чувствительность детекции установлена на уровне не менее 25 нг белка.
Относительная подвижность основных полос образцов при проявлении антителами Mab 706-C5, 711-66 и TS29 отличалась не более чем на 5 %.
Надежность метода определяли по устойчивости электрофоретической подвижности основной полосы при изменении времени пробоподготовки образцов. Результаты показали, что увеличение времени экспозиции испытуемых образцов в буферном растворе с ДТТ до 10 мин не приводило к существенному изменению относительной подвижности основной полосы (95–105 % от номинального значения).
Метод Лоури с десорбцией рекомендован для сорбированных лекарственных средств с концентрацией общего белка 40–160 мкг/мл [5]. Оценку пригодности предлагаемой аналитической методики проводили по показателям: специфичность, линейность результатов, правильность, воспроизводимость, надежность.
После проведения десорбции исследуемый образец содержит только следовые количества растворителя и вспомогательных веществ, поэтому оценку специфичности методики проводили одновременно с определением правильности при использовании стандартного и экспериментального образца ГЛФ, имеющего повышенную нагрузку по сорбированному веществу (400 мкг/мл).
Проведенные исследования показали, что средняя концентрация белка в образцах ГЛФ составляла 97–114 % от теоретического значения нагрузки по сорбированному веществу, которое рассчитывали исходя из концентрации белка в полупродукте до сорбции, определяемой методом с бицинхониновой кислотой [1]. Относительное стандартное отклонение (RSD, %) по 3 независимым измерениям образцов не превышало 7 %.
Для установления диапазона линейности методики использовали три экспериментальные серии ГЛФ с нагрузкой 50, 100 и 200 мкг по общему сорбированному белковому антигену. Рассчитанное уравнение линейной регрессии имело вид y = 0,0012x – 0,0051; квадрат коэффициента корреляции линейной регрессии R2 = 0,9798, что подтверждает строгую линейность рассматриваемой зависимости.
Оценку повторяемости и воспроизводимости предлагаемой методики проводили путем статистической обработки результатов 5 измерений стандартного образца ГЛФ в рамках однократной постановки эксперимента и в 3 различных экспериментах, выполненных разными операторами в разные дни. Во всех случаях относительное стандартное отклонение содержания белка, рассчитанное для одного образца, не превышало 5 %. Полученные результаты свидетельствуют о высокой воспроизводимости метода.
Надежность методики устанавливали по стабильности результатов, полученных для свежеприготовленного образца и образцов, приготовленных за 60 и 120 мин до измерения. Приготовленные образцы хранились при температуре от 2 до 8 °С. Полученные результаты показали, что образец является стабильным в течение 120 мин. Отклонение результатов измерений в этом временном диапазоне не превышало 5 %.
Основные аналитические характеристики методики для оценки полноты сорбции (специфичность, правильность, воспроизводимость, стабильность) были установлены в процессе валидации определения содержания общего белка методом Лоури с десорбцией. Для подтверждения пригодности аналитической методики определяли линейность и воспроизводимость.
В соответствии со спецификацией надосадочная жидкость ГЛФ может содержать не более 5 % от сорбированного вещества, то есть от 0 до 20 мкг/мл белка, а чувствительность метода Лоури ограничивается диапазоном 20–200 мкг/мл, в качестве экспериментальных образцов использовали надосадочную жидкость стандартного образца ГЛФ, сконцентрированную в микроцентрифужных концентраторах с отсечением по молекулярной массе 10 кДа (Sartorius/Vivaspin 6, кат. № VS0651) в 5 и 10 раз. В качестве образца сравнения для оценки специфичности метода использовали раствор рекомбинантных белков до сорбции в концентрации 100 мкг/мл. По результатам измерений концентрация белка в одном и том же образце ГЛФ была кратна степени концентрирования при относительном стандартном отклонении не более 20 % и не превышала 20 мкг на 1 мл надосадочной жидкости. Линейность измерений устанавливали в полном диапазоне чувствительности метода (20–200 мкг/мл), с использованием стандартного образца раствора рекомбинантных белков. Рассчитанное уравнение линейной регрессии имело вид y = 0,0012х + 0,0068; квадрат коэффициента корреляции линейной регрессии R2 = 0,9531, что подтверждает строгую линейность рассматриваемой зависимости в рабочем диапазоне методики.
Количественное определение содержания адъюванта является неотъемлемой частью процесса контроля качества сорбированных вакцин. Содержание алюминия гидроксида в препарате установлено в соответствии с отечественными и международными требованиями на уровне, не превышающем допустимый лимит (не более 1,25 мг алюминия), и составляет не менее 0,32 и не более 0,48 мг на дозу [5, 7, 12]. Определение проводили методом комплексонометрического титрования [1].
Спецификация показателя рН в диапазоне от 7,0 до 7,6 [6] введена на основании данных по стабильности белка и оптимальных условиях его сорбции. В соответствии с требованиями к растворам для инъекций терапевтическую вакцину контролировали по показателям: механические включения, прозрачность и цветность раствора, а также извлекаемый объем [2, 4].
Источник
Не мазью единой
Поделиться:
Для лечения кожных и других наружных заболеваний, а также в косметологической практике могут использоваться различные формы препаратов. Это присыпки (пудры), примочки, лосьоны, взбалтываемые взвеси (болтушки), спреи, гели, пасты, масла, кремы, мази и т. д.
Довольно часто случается ситуация, когда пациент, получив от врача название лекарства для нанесения на кожу, уже перед самой покупкой сталкивается с выбором — мазь или крем? (иногда умученные оптимизацией коллеги забывают указать)Название одно и то же, цена отличается чуть-чуть… Отличаются ли эти лекарственные формы и как поступить правильно?
Внимание! В нижеследующем тексте терминология дана в том виде, в каком она используется официальной медициной (в основном дерматологами); производители различных линеек косметических средств и средств для эстетической медицины с целью лучшей промоции сколь угодно широко трактуют слово «крем», хотя по сути это может оказаться мазью или даже пастой.
О лекарственных формах
Начнем с того, что действующего вещества в современных дерматологических препаратах достаточно мало — миллиграммы, а иногда и доли миллиграммов на одну дозу. А для того что равномерно распределить это самое вещество по зоне поражения, используется основа. И от нее зависит, на какую стадию воспалительного процесса будет действовать лекарство, а также сила, длительность и глубина воздействия.
Гель — имеет мягкую и вязкую консистенцию. Делается обычно на водной основе, не содержащей жиров и масел. Это важно, когда, с одной стороны, нужно обеспечить длительное и удобное применение (что невозможно, например, для медицинских примочек), а с другой стороны, хочется избежать гидрофобных компонентов, нарушающих свободный отток из кожных желез (например, при лечении розацеа и обычных угрей).
Крем — форма, основа которой содержит масла, воду и эмульгатор, позволяющий им взаимодействовать. Современные кремы, как правило, многокомпонентны. Крем хорошо впитывается в кожу, уже через несколько минут после нанесения не пачкает одежду, не оставляет жирного блеска на коже. Глубина проникновения действующего вещества меньше, чем у мази. Применяется при воспалительных реакциях, может наноситься на более нежные участки тела.
Мазь — форма, содержащая в своей основе большее количество жиров. Характеризуется наибольшей глубиной проникновения действующего вещества. Рекомендуется для лечения сухих кожных высыпаний при наличии инфильтрации (уплотнения) в коже. Как правило, наносится на открытую кожу. Применение мазей «под повязку» (строго по рекомендации врача) еще больше увеличивает глубину проникновения действующего вещества (такое иногда необходимо при застарелых псориатических бляшках). Мази не следует применять на мокнущие кожные высыпания. Поскольку жировые компоненты мазей не впитываются в кожу, они могут пачкать одежду, что не всегда приемлемо в амбулаторной практике.
Лосьон — жидкая лекарственная форма, основа которой содержит спирты и воду. В готовых лекарственных формах применяется в основном для лечения волосистой части головы (так как практически не пачкает волосы).
Паста — содержит не менее 20 % сухого вещества. Пасты назначают в тех случаях, когда требуется адсорбирующее и подсушивающее действие. Лекарственные вещества в пастах плохо всасываются кожей, поэтому действие их в пастах слабее, чем в мазях.
О возможности замены
Самостоятельные (без участия доктора, который делал назначения) замены одной лекарственной формы на другую крайне нежелательны, даже если концентрация действующего вещества у них совпадает (а она совпадает не всегда, проверяйте!).
Однако жизнь сложнее правил. Если вы находитесь в местности, где очень мало аптек и нет выбора препаратов, или доктор не указал форму и т. п., то можно заменить мазь кремом (если действующее вещество там в той же дозе), но не наоборот!
В крайнем случае вы немного потеряете в эффективности, все-таки крем обычно оказывает менее выраженное действие. Зато хотя бы осложнений не будет… в отличие от обратной замены (если мазь по незнанию нанести на более воспаленный участок, чем это допустимо).
Об одновременном использовании
Современные лекарственные формы (по крайней мере те, что назначаются дерматологами, а не приобретаются по совету соседок и авторов колонок про ЗОЖ из доморощенных газет) давно не содержат в себе жутких количеств свиного или бычьего жира, вазелина, ланолина. Сейчас это, как правило, сложные многокомпонентные системы. Они хорошо впитываются, обеспечивая нужную концентрацию действующего вещества на нужной глубине, не загрязняют одежду и кожу, имеют пониженную кратность применения.
ВАЖНО! Если доктор не указал иначе, лекарственные формы нельзя смешивать, так при взаимодействии они могут разрушаться. Если есть необходимость применения сразу нескольких препаратов — их следует наносить в шахматном порядке, чередуя участки, или чередуя нанесение по времени.
О хранении
Кроме того, есть ограничения по хранению.Срок хранения, указанный на упаковке, — это срок хранения запечатанного препарата. После вскрытия он не превышает 6 месяцев (если прямо не указано иначе) для мазей в тюбиках, 3 месяцев — для мазей в банках, 1 месяца — для кремов. Некоторые препараты специально маркируются значком с открытой упаковкой и сроком хранения.
В холодильник следует помещать только те препараты, которые должно хранить там по инструкции. Остальные хранятся при комнатной температуре, в отсутствие повышенной влажности, прямых солнечных лучей, нагревания.
Источник
