Фармакокинетический параметр лекарственных средств

10. Фармакокинетика и фармакодинамика – определение, разделы. Основные показатели фармакокинетики.

Фармакокинетика — это раздел фармакологии о всасывании, распределении в организме, депонировании, метаболизме и выведении веществ.

I. Пути введения лекарственных веществ – энтеральные (пероральный, сублингвальный, ректальный), парентеральные без нарушения целостности кожных покровов (ингаляционный, вагинальный) и все виды инъекций (подкожные, внутримышечные, внутривенные, внутриартериальные, внутриполостные, с введением в спинно-мозговой канал и др.). II. Всасывание лекарственных средств при разных путях введения в основном происходит за счет пассивной диффузии через мембраны клеток, путем фильтрации через поры мембран и пиноцитоза). Факторы, влияющие на всасывание: растворимость вещества в воде и липидах, полярность молекулы, величина молекулы, рН среды, лекарственная форма; биодоступность (количество неизмененного вещества в плазме крови относительно исходной дозы препарата), учитывающая потери вещества при всасывании из желудочно-кишечного тракта и при первом прохождении через печеночный барьер (биодоступность при внутривенном введении принимают за 100 %). Распределение лекарственных веществ в организме в большинстве случаев оказывается неравномерным и зависит от состояния биологических барьеров – стенки капилляров, клеточных мембран, плацентарного и гематоэнцефалического барьеров. Трудности преодоления последнего обусловлены его структурными особенностями: эндотелий капилляров мозга не имеет пор, в них отсутствует пиноцитоз, они покрыты глиальными элементами, выполняющими функцию дополнительной липидной мембраны (в ткань мозга легко проникают липофильные молекулы). Распределение лекарственных веществ зависит также от сродства последних к разным тканям и от интенсивности тканевого кровоснабжения; обратимое связывание лекарственных веществ с плазменными (преимущественно альбумином) и тканевыми белками, нуклеопротеидами и фосфолипидами способствует их депонированию. III. Биотрансформация (превращение) лекарственных веществ в организме (метаболическая трансформация, конъюгация или метаболическая трансформация) – превращение лекарственных веществ путем окисления (с помощью микросомальных ферментов печени при участии НАДФ, О₂ и цитохрома Р-450), конъюгация – присоединение к лекарственному веществу или его метаболиту химических группировок и молекул эндогенных соединений (глюкуроновой и серной кислот, аминокислот, глютатиона, ацетильных и метильных групп); результат биотрансформации – образование более полярных и водорастворимых соединений, легко удаляющихся из организма. В процессе биотрансформации активность вещества обычно утрачивается, что лимитирует время его действия, а при заболеваниях печени или блокаде метаболизирующих ферментов продолжительность действия увеличивается (понятие об индукторах и ингибиторах микросомальных ферментов). IV. Выведение лекарственных веществ из организма в основном осуществляется с мочой и желчью: с мочой выводятся вещества путем фильтрации и активной кальциевой секреции; скорость их выведения зависит от скорости реабсорбции в канальцах за счет простой диффузии. Для процессов реабсорбции важное значение имеет рН мочи (в щелочной среде быстрее выводятся слабые кислоты, в кислой – слабые основания); скорость выведения почками характеризует почечный клиренс (показатель очищения определенного объема плазмы крови в единицу времени). При выделении с желчью лекарственные вещества покидают организм с экскрементами и могут подвергаться в кишечнике повторному всасыванию (кишечнопеченочная циркуляция). В удалении лекарственных веществ принимают участие и другие железы, включая молочные в период лактации (возможность попадания в организм грудного ребенка лекарств); одним из принятых фармакокинетических параметров является период полувыведения вещества (период полужизни Т1/2), отражающий время, в течение которого содержание вещества в плазме снижается на 50 %.

Основные показатели фармакокинетики

– Константа скорости абсорбции(Ка), характеризующая скорость их поступле­ния в организм.

– Константа скорости элиминации (Кel), характеризующая скорость их био­трансформации в организме.

– Константа скорости экскреции(Кex), характеризующая скорость их выведе­ния из организма (через легкие, кожу, пищеварительный и мочевой тракт).

– Период полуабсорбции (Т_1/2, a) как время, необходимое для всасывания их поло­винной дозы из места введения в кровь (Т_1/2, a = 0,693/Ка).

– Период полураспределения (Т_1/2, a) как время, за которое их концентрация в крови достигает 50 % от равновесной между кровью и тканями.

– Период полувыведения(Т_1/2) как время, за которое их концентрация в крови уменьшается наполовину (Т_1/2 = 0,693/Кel).

– Кажущаяся начальная концентрация (С₀), которая была бы достигнута в плаз­ме крови при их внутривенном введении и мгновенном распределении в орга­нах и тканях.

– Равновесная концентрация (Сss), устанавливаемая в плазме (сыворотке) крови при их поступлении в организм с постоянной скоростью (при прерывистом введении (приеме) через одинаковые промежутки времени в одинаковых до­зах выделяют максимальную (Сss_max) и минимальную (Сss_min) равновесные концентрации).

– Объем распределения (Vd) как условный объем жидкости, в котором необхо­димо растворить поступившую в организм их дозу (D) для получения концен­трации, равная кажущейся начальной (С0).

– Общий (Clt), почечный (Clr) и внепочечный (Cler) клиренсы, характеризую­щие скорость освобождения от них организма и, соответственно, выведение их с мочой и другими путями (прежде всего с желчью) (Clt = Clr + Cler).

– Площадь под кривой «концентрация-время» (AUC), связанная с их другими фа­рмакокинетическими характеристиками (объемом распределения, общим клиренсом), при их линейной кинетике в организме величина AUC пропор­циональна дозе, попавшей в системный кровоток.

– Абсолютная биодоступность (f) как часть дозы, достигшая системного крово­тока после внесосудистого введения (%).

Показателем элиминации лекарственного препарата является клиренс (мл/мин). Выделяют общий, почечный и печеночный клиренс. Общий клиренс есть сумма по­чечного и печеночного клиренсов и определяется как объем плазмы крови, который очищается от лекарственного препарата за единицу времени. Клиренс используется для расчета дозы лекарственного препарата, необходимой для поддержания его рав­новесной концентрации (поддерживающей дозы) в крови. Равновесная концентрация устанавливается, когда количество абсорбирующегося и количество вводимого пре­парата равны друг другу.

В изучении фармакокинетики лекарственных препаратов важное место занимает математическое моделирование.

Существует много математических методов и моделей, от простейших одномер­ных до разного уровня сложности многомерных.

Использование математического моделирования позволяет в деталях с выведе­нием характерных констант исследовать фармакокинетику лекарственных препа­ратов, как по времени, так и пространству (по органам и тканям).

Фармакодинамика — раздел, изучающий биологические эффекты веществ, их локализацию и механизм действия.

Основные Положения Фармакодинамики

I. Виды фармакологического действия лекарств (местное, резорбтивное, прямое и косвенное, рефлекторное, обратимое, необратимое, преимущественное, избирательное, специфическое действие). Во всех случаях лекарственное вещество взаимодействует с определенными биохимическими субстратами; активные группировки макромолекулярных субстратов, взаимодействующих с веществами, получили название рецепторов, а рецепторы, взаимодействие с которыми обеспечивает основное действие вещества, называются специфическими. Сродство вещества к рецептору, приводящее к образованию с ним комплекса, обозначается термином «аффинитет»; способность вещества при взаимодействии с рецептором вызывать тот или иной эффект называется внутренней активностью; вещество, при взаимодействии с рецептором вызывающее биологический эффект, называется агонистом (они и есть внутренне активные); агонизм может быть полным (вещество вызывает максимальный эффект) и частичным (парциальным). Вещества, при взаимодействии с рецептором не вызывающие эффекта, но устраняющие эффект агониста, называются антагонистами. II. Типовые механизмы действия лекарственных веществ (миметическое, литическое, аллостерическое, изменение проницаемости мембран, освобождение метаболита от связи с белками и др.). III. Фармакологические эффекты – прямые и косвенные. IV. Виды фармакотерапевтического действия (этиотропное, патогенетическое, симптоматическое, главное и побочное).

Механизмы действия лекарственных средств.

Подавляющее большинство лекарственных средств оказывает лечебное действие путем изменения деятельности физиологических систем клеток, которые вырабатывались у организма в процессе эволюции. Под влиянием лекарственного вещества в организме, как правило, не возникает новый тип деятельности клеток, лишь изменяется скорость протекания различных естественных процессов. Торможение или возбуждение физиологических процессов приводит к снижению или усилению соответствующих функций тканей организма.

Лекарственные средства могут действовать на специфические рецепторы, ферменты, мембраны клеток или прямо взаимодействовать с веществами клеток. Подробно механизмы действия лекарственных веществ изучаются в курсе общей или экспериментальной фармакологии. Ниже мы приводим лишь некоторые примеры основных механизмов действия лекарственных средств.

Действие на специфические рецепторы. Рецепторы — макромолекулярные структуры, избирательно чувствительные к определенным химическим соединениям. Взаимодействие химических веществ с рецептором приводит к возникновению биохимических и физиологических изменений в организме, которые выражаются в том или ином клиническом эффекте.

Препараты, прямо возбуждающие или повышающие функциональную активность рецепторов, называют агонистами, а вещества, препятствующие действию специфических агонистов, — антагонистами. Антагонизм может быть конкурентным и неконкурентным. В первом случае лекарственное вещество конкурирует с естественным регулятором (медиатором) за места связывания в специфических рецепторах. Блокада рецептора, вызванная конкурентным антагонистом, может быть устранена большими дозами вещества-агониста или естественного медиатора.

Разнообразные рецепторы разделяют по чувствительности к естественным медиаторам и их антагонистам. Например, чувствительные к ацетилхолину рецепторы называют холинэргическими, чувствительные к адреналину — адренергическими. По чувствительности к мускарину и никотину холинергические рецепторы подразделяются на мускариночувствительные (м-холинорецепторы) и никотиночувствительные (н-холинорецепторы). Н-холинорецепторы неоднородны. Установлено, что их отличие заключается в чувствительности к различным веществам. Выделяют н-холинорецепторы, находящиеся в ганглиях автономной нервной системы, и н-холинорецепторы поперечнополосатой мускулатуры. Известны различные подтипы адренергических рецепторов, обозначаемые греческими буквами α₁,α ₂, β_1, β₂.

Выделяют также H₁— и Н₂-гистаминовые, допаминовые, серотониновые, опиоидные и другие рецепторы.

Влияние на активность ферментов. Некоторые лекарственные средства повышают или угнетают активность специфических ферментов. Например, физостигмин и неостигмин снижают активность холинэстеразы, разрушающей ацетилхолин, и дают эффекты, характерные для возбуждения парасимпатической нервной системы. Ингибиторы моноаминоксидазы (ипразид, ниаламид), препятствующие разрушению адреналина, усиливают активность симпатической нервной системы. Фенобарбитал и зиксорин, повышая активность глюкуронилтрансферазы печени, снижают уровень билирубина в крови.

Физико-химическое действие на мембраны клеток. Деятельность клеток нервной и мышечной систем зависит от потоков ионов, определяющих трансмембранный электрический потенциал. Некоторые лекарственные средства изменяют транспорт ионов.

Так действуют антиаритмические, противосудорожные препараты, средства для общего наркоза.

Прямое химическое взаимодействие. Лекарственные средства могут непосредственно взаимодействовать с небольшими молекулами или ионами внутри клеток. Например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) прочно связывает ионы свинца. Принцип прямого химического взаимодействия лежит в основе применения многих антидотов при отравлениях химическими веществами. Другим примером может служить нейтрализация соляной кислоты антацидными средствами.

Является важным фармакодинамическим показателем. Обычно этот показатель представляет собой не простое арифметическое отношение и может графически выражаться по-разному: линейно, изогнутой вверх либо вниз кривой, сигмоидальной линией.

Каждое лекарство обладает рядом желательных и нежелательных свойств. Чаще всего при увеличении дозы лекарства до определенного предела желаемый эффект возрастает, но при этом могут возникать нежелательные эффекты. Лекарство может иметь не одну, а несколько кривых отношения «доза-эффект» для его различных сторон действия. Отношение доз лекарства, при которых вызывается нежелательный или желаемый эффект, используют для характеристики границы безопасности или терапевтического индекса препарата. Терапевтический индекс препарата можно рассчитывать по соотношению его концентраций в плазме крови, вызывающих нежелательные (побочные) эффекты, и концентраций, оказывающих терапевтическое действие, что более точно может характеризовать соотношение эффективности и риска применения данного лекарства.

Методы для изучения фармакодинамики должны обладать рядом важных свойств:

а) высокой чувствительностью — способностью выявлять большую часть тех отклонений от исходного состояния, на которое пытаются воздействовать, а также оценивать положительные изменения в организме.

б) высокой специфичностью — способностью относительно редко давать «ложноположительные» результаты.

в) высокой воспроизводимостью — способностью данным методом стабильно отображать характеристики состояния больных при повторных исследованиях в одинаковых условиях у одних и тех же больных при отсутствии какой-либо динамики в состоянии этих больных по другим клиническим данным.

Источник

Сравнительное фармакокинетическое исследование биоэквивалентности двух пролонгированных лекарственных форм метопролола

Полный текст:

Аннотация

Полученные результаты не позволяют сделать вывод о совпадении основных фармакокинетических параметров метопролола и о биоэквивалентности исследуемых лекарственных форм. Препарат «БЕТАЛОК ЗОК» обладает лучшими фармакокинетическими характеристиками, снижающими колебания концентрации в интервале дозирования, т.е. позволяющими более надежно поддерживать постоянный уровень концентрации метопролола (явно выраженное плато на фармакокинетической кривой). Препарат «ЭМЗОК» значительно быстрее всасывается из лекарственной формы, уровень максимальной концентрации метопролола в крови существенно выше, чем при применении препарата «БЕТАЛОК ЗОК», т.е. этот препарат более напоминает обычную лекарственную форму метопролола. Более высокие пиковые концентрации, создаваемые в крови препаратом ЭМЗОК, могут явиться причиной зависящих от концентрации побочных эффектов. Таким образом применять ЭМЗОК по схеме, применяемой при лечении препаратом «БЕТАЛОК ЗОК» (суточные дозы, разовые дозировки, режимы дозирования) не представляется возможным. «БЕТАЛОК ЗОК» назначают один раз в сутки, т.е. с интервалом 24 часа. По нашим предварительным расчетам, для того чтобы получить сравнимые уровни метопролола в крови, сравнимые колебания концентрации в интервале дозирования, обеспечивающие сравнимую эффективность при применении препарата «ЭМЗОК», его необходимо назначать два раза в сутки. В настоящее время нами проводятся расчеты и сравнение режимов дозирования для этих двух препаратов на основе фармакокинетического моделирования. На основании проведенного исследования можно сделать вывод о том, что применение препарата «БЕТАЛОК ЗОК» повышает эффективность и безопасность лечения.

Ключевые слова

Для цитирования:

Соколов А.В., Белоусов Ю.Б., Тищенкова И.Ф. Сравнительное фармакокинетическое исследование биоэквивалентности двух пролонгированных лекарственных форм метопролола. Клиническая фармакокинетика . 2004;(1):27-33.

Большое количество выпускаемых различными фирмами воспроизводимых лекарственных препаратов совсем не означает одинакового фармакологического и терапевтического действия этих лекарств. Для того чтобы ориентироваться в правильном назначении того или иного препарата, врачу необходимо знать, чем отличаются воспроизводимые лекарства (иными словами – знать отличия фармакокинетических параметров этих препаратов). На основании этих знаний врач может грамотно назначать дозировку лекарства и подбирать оптимальные интервалы дозирования. Во всем мире для подтверждения одинаковой терапевтической активности воспроизводимых препаратов проводятся исследования биоэквивалентности. При этом в качестве основного критерия выбирается одинаковая биодоступность сравниваемых лекарственных средств, определяемая сравнением площадейпод кривыми в координатах «концентрация-время» — AUC. Кроме этого критерия в последнее время используется и ряд других сравниваемых фармакокинетических параметров: MRT (среднее время удержания), Cmax (максимальная концентрация), Tmax (время достижения максимальной концентрации) и некоторые другие параметры. Большое значение имеет вариабельность получаемых данных.

Дело в том, что при одинаковых значениях площадей (AUC) совсем необязательно, что исследуемый препарат будет одинаково всасываться и выводиться из организма также как и препарат, выбранный в качестве стандарта.

Целью настоящего исследования было исследовать биоэквивалентность двух препаратов пролонгированного действия, содержащих метопролол в одинаковых количествах – 50 мг, на основании полученных фармакокинетических данных — «БЕТАЛОК в30К» и «ЭМ3ОК».

Метопролол — белый кристаллический порошок. Хорошо растворим в воде, умеренно растворим в этаноле, слабо растворим в дихлорметане.

Кардиоселективный бета1-адреноблокатор без внутренней симпатомиметической активности. Оказывает гипотензивное, антиангинальное и антиаритмическое действие. Блокирует преимущественно бета1-адренорецепторы сердца, не обладает внутренней симпатомиметической и мембраностабилизирующей активностью. Уменьшает сердечный выброс и CАД, замедляет сердечный ритм, ослабляет стимулирующий эффект катехоламинов на миокард при физической нагрузке и умственном перенапряжении, предупреждает рефлекторную ортостатическую тахикардию. Антигипертензивное действие обусловлено уменьшением сердечного выброса и синтеза ренина, угнетением активности ренин%ангиотензиновой системы и ЦНС, восстановлением чувствительности барорецепторов и, в итоге, уменьшением периферических симпатических влияний. Гипотензивный эффект достигается быстро и продолжается в течение 6 часов. При применении метопролола сукцината – клинический эффект сохраняется 24 ч. Антиангинальный эффект является следствием уменьшения частоты и силы сердечных сокращений, энергетических затрат и потребности миокарда в кислороде. Антиаритмическое действие проявляется в устранении аритмогенных симпатических влияний на проводящую систему сердца, замедлении синусового ритма и скорости распространения возбуждения через АV узел. Понижает автоматизм синусового узла, уменьшает ЧСС, замедляет AV проводимость, снижает сократимость и возбудимость миокарда, уменьшает минутный объем сердца, снижает потребность миокарда в кислороде.

Фармакокинетика метопролола всесторонне представлена в работах 6. При пероральном приеме обычных лекарственных форм метопролола в дозе 50 мг препарат быстро абсорбируется и достигает максимальной концентрации (Cmax) от 5 до 22 нг/мл, а время ее достижения (Tmax) находится между 2,5 и 14 ч после приема. Т1/2 колеблется от 3 до 7 часов. Биодоступность метопролола тартрата составляет около 50% при первом приеме и возрастает до 70% при повторном применении. Метаболизируется в печени с получением двух активных метаболитов. При пероральном приеме менее 5% принятой дозы выводится с мочой в неизмененном виде. Быстро распределяется в тканях, проникает через гематоэнцефалический и плацентарные барьеры, обнаруживается в грудном молоке в более высокой концентрации, чем в плазме. При нарушении функции почек биодоступность препарата не изменяется, но может снижаться скорость экскреции метаболитов.

В данном исследовании определяли относительную биодоступностьдвух препаратов метопролола пролонгированного действия, представленных на рынке России, при однократном пероральном приеме 50 мг препарата. Тестируемым препаратом (Test) являлся генерический препарат «ЭМ3ОК», содержащий метопролол тартрат , а в качестве препарата сравнения использовали оригинальный препарат «БЕТАЛОК в30К» (Standard), содержащий метопролол сукцинат. Оба препарата применялись в дозе 50 мг. Изученные данные in vitro говорили о примерно одинаковых фармацевтических характеристиках этих препаратов. Но поскольку данные, полученные in vitro, не всегда являются прогностически достоверными в отношении действия препарата in vivo, было интересно провести исследование биоэквивалентности на здоровых добровольцах для оценки взаимозаменяемости оригинального и генерического препарата. В настоящей работе представлены экспериментальные данные, полученные в результате проведенного исследования.

Объект и методы исследования

Участники
В работу были включены 18 здоровых добровольцев, разбитых на 2 группы (группа А и группа Б). Группы были рандомизированы по полу, возрасту, массе тела. Демографические и некоторые другие данные представлены в табл.1 и 2.

Таблица 1. Демографические данные участников исследования

№ п/п ФИО Возраст Масса тела Рост Пол Группа 1 Б.А.П. 37 90 187 М А 2 Н.Ю.К. 47 80 176 М А 3 А.Н.В. 32 52 160 Ж А 4 И.Л.Н. 45 60 154 Ж А 5 И.П.Е. 20 60 170 Ж А 6 М.Л.А. 45 65 162 Ж А 7 М.Н.В. 43 80 160 Ж А 8 К.Н.М. 45 70 156 Ж А 9 К.Н.А. 20 73 156 Ж А 10 К.А.И. 45 70 170 М В 11 Л.Т.А. 24 60 154 Ж В 12 С.Н.В. 45 90 160 Ж В 13 С.С.Г. 45 94 176 М В 14 Л.С.Н. 30 56 176 Ж В 15 У.А.М. 40 90 187 М В 16 П.Л.С. 44 70 160 Ж В 17 Б.Е.Н. 33 60 168 Ж В 18 Д.Л.В. 45 70 160 Ж В Среднее зн. 38,05 71,70 166,2 — — Станд.ош. ± 2,18 3,07 2,49 — —

Таблица 2.

№ п/п Параметр Группа «А» Группа «Б» 1 количество чел. 9 9 2 возраст, лет 37,25 39,3 3 масса тела, кг 69,70 73,4 4 доза, мг 1 табл. (50 мг) 1 табл. (50 мг)

После того как врач-исследователь проинформировал участников о целях, ходе и возможном риске проведения данного исследования, все добровольцы подписали информированное согласие на участие в исследовании. Они были подобраны на основании данных анамнеза, физикального обследования, в ходе которого было установлено отсутствие видимой патологии печени, почек, сердца, ЖКТ и крови или каких-либо острых или хронических заболеваний.

Всесторонний лабораторный скрининг проводили в течение 7 дней до начала исследования в целях подтверждения удовлетворительного состояния участников. Другими критериями включения являлись отрицательные тесты на содержание наркотиков, алкоголя, ВИЧ и др. Исследование проводилось согласно требованиям, указанным в методических рекомендациях по проведению исследований по биоэквивалентности в Российской Федерации от 2002 г.

Исследуемые препараты
В качестве тестируемого препарата был выбран «ЭМ3ОК» (Галена, Чешская Республика) в таблетках по 50 мг (№ серии 3А1070403), а в качестве препарата сравнения избрали «БЕТАЛОК ЗОК» (Астра Зенека, Швеция) в таблетках по 50 мг (№ серии D13085).

Дизайн исследования
Исследование было рандомизированным двойным перекрестным, основанным на однократном приеме дозы препарата 18 здоровыми добровольцами. Как участники, так и исследователи могли знать, какой препарат получает тот или иной человек в каждый период, однако этой информацией не обладала аналитическая группа.

Каждый доброволец утром во время завтрака принимал 1 таблетку препарата (50 мг), которые запивал 200 мл кипяченой воды комнатной температуры. Группа А получала 1 таблетку (50 мг) препарата «БЕТАЛОК ЗОК», а группа Б — 1 таблетку (50 мг) препарата «ЭМЗОК». Через 7 дней (период отмывки) группа А получала 1 таблетку (50 мг) препарата «ЭМЗОК», а группа Б — 1 таблетку (50 мг) препарата «БЕТАЛОК ЗОК».

Пробы крови в количестве 5,0 мл получали из локтевой вены методом венопункции или из установленного в локтевой вене катетера. Пробы отбирали в стерильные, герметично закрывающиеся одноразовые пластиковые пробирки. Из крови готовили сыворотку обычным способом (инкубация при комнатной температуре 30-45 мин, центрифугирование при 5600 об/мин, 10 мин) и сразу замораживали полученную сыворотку при -18ºС. Анализ сыворотки на содержание в ней метопролола проводили не позже, чем на 2-е сутки. Пробы крови отбирали до и через 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0; 24 и 48 часов после приема препарата по следующей схеме:

Группа «А» — до и через 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0; 24 и 48 часов после приема препарата «БЕТАЛОК ЗОК» (1 таблетка — 50 мг);

Группа «Б» — до и через 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0; 24 и 48 часов после приема препарата «ЭМЗОК» (1 таблетка — 50 мг).

После периода отмывки (7 дней) группа «А» принимала по той же схеме препарат «ЭМЗОК», а группа «Б» — препарат «БЕТАЛОК ЗОК».

Аналитический метод
Из многочисленных описанных в литературе методов определения метопролола в сыворотке крови в основном применяются методы, основанные на применении обратнофазной ВЭЖХ 7.

В основном, эти методы основаны на применении ВЭЖХ с ультрафиолетовым или флюоресцентным детектированием. При этом применяется однократная или многократная экстракция препарата из сыворотки крови органическим растворителем с последующим упариванием в токе инертного газа или воздуха при низкой температуре (30%50ºС), растворением сухого остатка в ограниченном объеме растворителя (в большинстве случаев % элюента) и анализом полученного раствора на обратнофазной хроматографической колонке. Метод с использованием осаждения белков крови с последующим анализом надосадочной жидкости с помощью ВЭЖХ в случае определения препаратов этой группы не применим из%за низкой чувствительности метода и большого количества эндогенных веществ, мешающих определению. Кроме того, риск загрязнения хроматографической колонки недоосажденными белками крови из супернатанта при данном способе определения существенно возрастает.

Нами был использован модифицированный метод определения, описанный в работе [8]. Модификация состояла в том, что была предложена новая подвижная фаза, а хроматографическое разделение проводили на микроколонке Диасфер-100-С18, 6 мкм. Препарат извлекали из сыворотки крови экстракцией хлористым метиленом или хлороформом после подщелачивания пробы сыворотки разбавленным раствором едкого натра (коэффициент экстракции 98±1,5%).

К образцу сыворотки крови объемом 0,5 мл (здесь и далее – точные объемы) добавляли 100 мкл 0,1 н раствора едкого натра и 3,0 мл хлороформа. Смесь подвергалась энергичному встряхиванию на вибромиксере 2 мин, центрифугированию в течение 10 мин при 5600 об/мин. Затем 2,7 мл нижнего органического слоя отбирали автоматической пипеткой и упаривали экстракт в токе азота при 40ºС. Сухой остаток растворяли в 120 мкл подвижной фазы и 50 мкл полученного раствора вводили в хроматографическую систему. Хроматографическое разделение проводили при комнатной температуре (20±2ºС) на микроколонке Диасфер-100%С18, зернением 6 мкм и размерами 2*150 мм (сорбент разработан и упакован ЗАО «БиоХимМак СТ»). В качестве детектора использовали проточный спектрофлюориметр «Shimadzu» – 551 (Япония), детектирование проводили при длинах волн (lem=222 и lex=305 нм). В качестве подвижной фазы использовали смесь 87,7% ацетонитрила, 12,2% воды и 0,031% конц. ортофосфорной кислоты. Объемная скорость элюирования составляла 0,4 мл/мин. Концентрацию препарата рассчитывали по методу абсолютной калибровки.

Калибровочные операции проводили следующим образом: к 0,5 мл интактной сыворотки крови, полученной обычным способом добавляли известное количество препарата (стандартный раствор в метиловом спирте) для получения растворов с концентрацией 3, 10, 15, 40 и 90 нг/мл сыворотки (5 растворов). Полученные калибровочные растворы обрабатывали и анализировали описанным выше способом. Калибровочный график в изученном интервале концентраций представлял собой прямую линию (Kкорр.= 0,987) описываемую уравнением С = 0,143* h, где С — концентрация метопролола в сыворотке крови (в нг/мл), h — высота хроматографического пика (в мм).

Каждая проба крови анализировалась не менее двух раз.

Калибровочные кривые строили по результатам хроматографического анализа на основе измерений высот хроматографических пиков. Результаты анализа контрольных образцов вносили в таблицу, рассчитывали средние значения, стандартные ошибки и затем строили калибровочный график.

Измеренные значения концентраций на графике были линейны во всем исследованном диапазоне (0-100 нг/мл) и график представлял прямую линию.

Контрольные образцы для получения калибровочных графиков приготовляли трижды с интервалом в одну неделю. Образцы сыворотки крови, содержащие известное количество метопролола и находившиеся в морозильной камере при -18ºС в течении двух недель подвергали регулярному контрольному хроматографическому анализу каждые два дня. Установлено, что количество метопролола оставалось стабильным в течении всего периода наблюдения.

Порог чувствительности метода (абсолютная чувствительность по метопрололу в анализируемой пробе) составляла не ниже 0,5 нг метопролола в мл сыворотки крови. Относительная ошибка определения составила 8,79% при концентрации препарата 15 нг/мл.

Фармакокинетические расчеты
Основные фармакокинетические параметры метопролола, полученные в результате исследования двух препаратов приведены в табл 3. AUC для метопролола (представляет собой площадь под кривой «концентрация – время») были вычислены в соответствии с правилом трапеции с помощью специализированных компьютерных программ.

В добавление к этому для метопролола определяли соотношение Cmax/AUC и VRT (дисперсия среднего резидентного времени). AUC, Cmax, MRT и Cmax/AUC сравнивали методом вариационного анализа АNOVА. Были подсчитаны 90% доверительные интервалы. Все тесты и сравнения оценивали при уровне достоверности 95% (р?0,05).

Таблица 3. Фармакокинетические параметры метопролола после однократного перорального приема таблеток 50 мг «ЭМЗОК» (Test) и «БЕТАЛОК ЗОК» (Standard) (Средние значения)

Тmax, ч Cmax, нг/мл MRT, ч AUC0-48, нг*ч/мл «ЭМЗОК» 4,6±1,24 18,2±2,99 15,65±0,82 277,6±53,8 «БЕТАЛОК ЗОК» 8,1±1,61 10,4±2,19 20,05±1,26 249,4±53,9

Результаты и их обсуждение
AUC для метопролола может быть продлена до бесконечности с достаточной надежностью для всех случаев и таким образом ее можно сравнивать для двух препаратов у всех 18 добровольцев.

Для оценки биоэквивалентности препаратов «ЭМЗОК» (test) и «БЕТАЛОК ЗОК» (standard) был проведен статистический анализ полученных фармакокинетических данных. В качестве основных переменных при этом были выбраны показатели AUC (площадь под кривой), MRT, Cmax (максимальное значение), отношения Cmax/AUC соответствующих фармакокинетических кривых. Анализ проводился как для test , так и для standard.

На рис. 1 представлены графики изменения сывороточных концентраций метопролола во времени после однократного приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» (усредненные данные). Как видно из сравнения этих графиков, характер кривых зависимости содержания метопролола в крови после приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» отличается.

Рис. 1. Динамика концентраций метопролола в сыворотке крови добровольцев после перорального однократного приема 50 мг «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» (Средние значения).

Препарат из исследуемых форм достаточно продолжительное время всасывается в организме. Времена достижения максимальной концентрации и сами значения максимальной концентрации довольно значительно различаются. Так, в случае применения препарата «ЭМЗОК», содержание его в крови достигает максимального значения (18,2 ± 2,99 нг/мл) к Tmax = 4,60 ± 1,24 час. В случае применения препарата «БЕТАЛОК ЗОК» эти величины составляют по нашим данным (Tmax = 8,1 ± 1,61 и Сmax= 10,4 ± 2,19 нг/мл*ч), затем концентрация метопролола в крови монотонно убывает и после 48 часов после приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» практически не определяется. Наблюдаемые различия в концентрациях метопролола в крови добровольцев после приема таблеток «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» могут быть так же объяснены межиндивидуальной вариабельностью и различием в составах наполнителей лекарственных форм.

Кинетика метопролола после приема таблеток исследуемых лекарственных форм «БЕТАЛОК ЗОК» и «ЭМЗОК» удовлетворительно описывается однокамерными моделями с внемодельным всасыванием.

Период времени наблюдения T был равен 48 часам. Для статистического оценивания были сделаны предположения о распределении основных параметров:
1)параметр AUC имеет log%нормальное распределение,
2)параметры MRT и VRT % нормальное.
Статистический анализ включал в себя следующие процедуры: вычисление базовой и порядковой статистики, дисперсионный анализ, анализ остатков, графические методы, вычисление доверительных интервалов, вычисление и анализ отношений биоэквивалентности и относительной степени всасывания лекарственного вещества, определяемой отношением соответствующих максимальных концентраций, проверка интервальных критериев, критерия знаковых рангов Уилкоксона, построение гистограммы распределения парных геометрических средних отношений биоэквивалентности.

Для отношений биоэквивалентности и отношений соответствующих максимальных концентраций a-priori были установлены допустимые границы 0.8 — 1.2. При этом средние значения отношений биоэквивалентности должны быть в пределах 0.9 — 1.1, а отношения максимальных концентраций в пределах 0.85 — 1.15. Кроме того, должны быть недостоверны различия между основными переменными и отношениями Cmax/AUC на уровне значимости не менее 95 %.

Средние значения lnAUC в пределах интервала 0 — 48 часов были оценены как 5,61 ± 0,2 для test и 5,49 ± 0,24 для standard . Относительная биодоступность 117 ± 40 % с 90% доверительным интервалом Стьюдента 1,0 – 1,26 и интервалом, построенным с помощью программы ANOVA, 1,0 – 1,26. Для индивидуальных отношений биодоступности по правилу 75/125 2 значения были меньше и 4 больше заданных пределов.

Cmax для test была 18,2 ± 2,99 нгмл и для standard — 10,4 ± 2,19 нгмл. Значение парного t-критерия для разности средних значений равно 10,2.

Tmax было 4,6 ± 1,24 часов для test и 8,1 ± 1,61 для standard. Значение парного t-критерия для разности средних значений равно -7,62.

Для MRT – средние значения были оценены как 15,65 ± 0,82 часов для test и для standard 20,05 ± 1,26 часов. Значение парного t-критерия для разности средних значений равно — 12,7.

Для VRT – средние значения были оценены как 116,7 ± 11,54 часов в квадрате и 140,0 ± 6,35 часов в квадрате, соответственно для test и standard.

Для параметров сравнения Cmax, Tmax, MRT, VRT, Cmax/AUC нулевая гипотеза о том, что генеральные средние для этих параметров равны между собой, была отвергнута на уровне значимости (p 1. Malini Haria, Greg L. Plosker, Anthony Markham – Drugs, 59, 1, p. 141-157, 2000.

2. C.G. Regardt, K.O. Borg, et al – J. Pharmacokinet. Biopharmac., 2, 4, p. 347-364, 1974.

3. I. Darmansjah, E. Wong et al – J. Clin. Pharmacol., 30 (Suppl2), p. 39-45, 1990.

4. A. Sandberg, et al — J Clin. Pharmacol., 30, 2(Supp), p. 2-16, 1990.

5. J.Godbillon, A. Gerardin et al –Eur. J. Clin. Pharmacol., 24, 2(Supp), p. 655-660, 1983.

6. A. Sandberg, G. Ragnarson, et al – Eur.J. Clin. Pharmacol., 33 [Suppl], p.3-7,1988.

7. M.S. Lennard, J.H. Silas. J. Chromatogr.,272,p.205-209, 1988.

8. D.B.Pautler, W.J. Jusko — J. Chromatogr.,228,p.215-222, 1982.

9. J.Godbillon, M. Duval. — J. Chromatogr. BA, 309,p.198-302, 1984.

10. Yukio Horai, Takashi Ishiraki, et al., Ther. Drug Monit., 10, №4, p. 428-33, 1988.

11. Справочник по прикладной статистике. Под редакцией Э.Лойда, У.Ледермана. М.- Финансы и статистика — 1990.

Источник